Ingeniería de nanocápsulas para la silenciamiento eficiente de NSUN2 y una terapia inmunomoduladora en el cáncer colorrectal metastásico.

El cáncer colorrectal (CCR) representa una importante carga de salud a nivel mundial, caracterizado por una alta incidencia y tasas de mortalidad en todo el mundo. Según el estudio Global Burden of Disease (GBD), el CCR representó más de 1,9 millones de nuevos casos y aproximadamente 930.000 muertes en todo el mundo en 2020 [^[1]]. Se prevé que en 2030 haya 2,2 millones de nuevos casos y 1,1 millones de muertes por la enfermedad [^[2],^[3]]. Recientemente, subconjuntos favorables de cánceres de origen desconocido (CUP), en particular el subtipo de CUP similar al CCR, pueden influir en las tendencias observadas en la incidencia del CCR [^[4]]. A pesar de los avances en las terapias dirigidas y basadas en el sistema inmunitario, la resistencia terapéutica y la progresión metastásica siguen limitando los resultados de supervivencia. El papel de la heterogeneidad inmune en el CCR, señalando específicamente que la expresión de la proteína ligando de muerte programada 1 (PD-L1) es mayor en los tumores deficientes en la reparación del apareamiento de bases (MMR) (MSI-H) que en los casos con MMR competente (MSI-L), y los enfoques actuales de detección para la reparación defectuosa del apareamiento de bases del ADN, incluido el inmunohistoquímico (IHC) y las pruebas de inestabilidad de microsatélites (MSI), junto con sus desafíos biológicos y técnicos asociados [^[5]], y los reguladores de la metilación del ARN m5C también están involucrados en el microambiente inmunitario del CCR y el pronóstico [^[6]]. Las características de la infiltración de células inmunitarias y los procesos biológicos establecidos están consistentemente asociados con los fenotipos de modificación de m5C [^[7]]. El regulador de la metilación del ARN m5C NSUN2 está sobreexpresado en múltiples neoplasias y se asocia con la progresión tumoral y un mal pronóstico, como el cáncer de páncreas [^[8]], el cáncer de próstata [^[9]], el cáncer de colon [^[10]] y los carcinomas de células escamosas esofágicas [^[11]]. La sobreexpresión de NSUN2 afecta a las células del cáncer de mama y al potencial de NSUN2 como un objetivo terapéutico para el cáncer de mama [^[12],^[13]]. NSUN2 es un prometedor objetivo terapéutico para el tratamiento del cáncer de vesícula biliar [^[14]]. Su expresión se ha asociado con peores resultados en el cáncer de próstata [^[9]] y el cáncer de colon, particularmente en condiciones hipóxicas [^[10]], estabilizando el ARNm de TIAM2, lo que facilita la proliferación del cáncer de páncreas [^[15]], y la estabilización del ARNm de GRB en el carcinoma de células escamosas esofágico de forma dependiente de LIN28B, facilitando la progresión de la enfermedad. Por lo tanto, especulamos que la inhibición específica del NSUN2 a nivel del ARN puede ser una estrategia de tratamiento innovadora. Las terapias basadas en ARN enfrentan muchos obstáculos en términos de su eficacia y distribución selectiva a las células diana. Se han desarrollado ARN de interferencia y oligonucleótidos antisentido como herramientas de silenciamiento génico para aplicaciones terapéuticas. Las terapias basadas en ARN enfrentan importantes barreras de administración, que incluyen inestabilidad, baja permeabilidad de la membrana y atrapamiento endosomal [^[16],^[17]]. Aunque las nanopartículas lipídicas dominan la administración de ARN, los sistemas basados en polímeros ofrecen una mayor estabilidad y capacidad de ajuste [[^[18]], [^[19]], [^[20]]]. Se ha demostrado que las nanopartículas de PLA tienen la capacidad de provocar respuestas inmunológicas robustas in vivo contra varios antígenos modelo después de la administración parenteral [^[21]]. Dada las limitaciones persistentes de las terapias basadas en ARN en los tumores sólidos, hipotetizamos que la focalización epigenética selectiva del regulador de m5C NSUN2, combinada con la modulación de los puntos de control inmunitario, podría reprogramar la progresión tumoral y mejorar la respuesta inmunoterapéutica en el CCR.

A pesar de los rápidos avances en las terapias basadas en ARN, sigue existiendo una importante laguna de conocimiento en el desarrollo de sistemas de administración de ARN eficaces para el cáncer colorrectal, ya que las plataformas existentes están en gran medida optimizadas para la focalización hepática y enfrentan limitaciones como una mala especificidad tumoral, una administración intracelular ineficiente, una escasa salida endosomal y efectos fuera del objetivo. Para abordar esto, en este estudio, diseñamos una nanoplataforma de siRNA dirigida al tumor basada en nanopartículas de PLA funcionalizadas con RGD y el péptido de penetración celular KA26 para permitir la administración selectiva y la liberación citosólica eficiente del siRNA dirigido a NSUN2. El nanocomplejo resultante suprimió de forma robusta la expresión de NSUN2, inhibió la progresión metastásica in vivo y, cuando se combinó con el bloqueo de PD-L1 (anticuerpo anti-PD-L1), indujo una marcada regresión tumoral acompañada de una mayor infiltración de células T CD4+/CD8+ y apoptosis (Fig. 1). Estos hallazgos posicionan la focalización de la metilación del ARN como una estrategia para convertir el CCR inmunológicamente resistente en un estado terapéuticamente receptivo, proporcionando un marco informado mecánicamente para integrar el silenciamiento epigenético con la inmunoterapia.

Materiales y métodos

Preparación de poliplexos y nanocomplejos

Para formar los poliplexos, el siRNA se diluyó en agua libre de ARN hasta una concentración final de 40 ng/μL y se mezcló con los péptidos KA26 (KKALLAHALHLLALLALHLAHALKKA)/WA30 (WEARLARALARALARHLARALARALRACEA) (GL Biochem, Shanghái, China) a una concentración de 800 ng/μL. El poli(ácido láctico) (PLA) se disolvió primero en diclorometano y luego el disolvente se evaporó utilizando un evaporador rotatorio. La película de PLA resultante se dispersó en agua para obtener nanopartículas de PLA (PLA NPs). Se mezclaron volúmenes iguales de poliplexos de péptido/siRNA y PLA-NPs (0,5% p/v en agua; Millipore, Bedford, MA, EE. UU.) para formar nanocomplejos de PLA-NP/péptido/siRNA. Para los nanocomplejos funcionalizados con RGD, el PLA y los péptidos RGD se disolvieron conjuntamente en diclorometano, se evaporaron utilizando un evaporador rotatorio, se dispersaron en agua y luego se liofilizaron. Los PLA-NPs funcionalizados con RGD liofilizados se reconstituieron en agua, y se mezclaron volúmenes iguales con poliplexos de péptido/siRNA para formar nanocomplejos de PLA-RGD/péptido/siRNA. El diámetro hidrodinámico y el potencial zeta (carga superficial) de las formulaciones de ARN resultantes se midieron mediante dispersión de luz dinámica (DLS) utilizando un Malvern ZetaSizer Pro (Malvern Instruments, Reino Unido).

Estabilidad de las formulaciones

Se realizó un estudio de estabilidad para investigar los cambios temporales en las propiedades fisicoquímicas y la actividad biológica de las formulaciones de poliplexos y nanocomplejos. Los complejos se almacenaron en refrigeración (4 °C) durante 7 días. A intervalos regulares, se midieron el diámetro hidrodinámico y el potencial zeta utilizando la dispersión de luz dinámica (DLS) con un Malvern ZetaSizer Pro (Malvern Instruments, Reino Unido).

Eficiencia de expresión y captación celular

Para preparar los estudios de imagen, las células adherentes se sembraron un día antes y alcanzaron aproximadamente el 70% de confluencia en el grupo de tratamiento de 24 horas. Se añadió medio de crecimiento completo (1 mL) a cada pocillo y se añadieron los compuestos basados en PLA que contenían ARN-Cy5 (20 nM) u otras formulaciones de control apropiadas a cada pocillo. Las células se incubaron luego con la formulación durante el período de tiempo designado. Después del período de tiempo deseado, las células se lavaron suavemente con solución salina tamponada con fosfato de Dubelco (DPBS) para eliminar cualquier formulación restante. Se realizó la tinción nuclear con DAPI durante 15 minutos a temperatura ambiente según las instrucciones del fabricante. Las células se fijaron luego con un 4% de paraformaldehído en PBS durante 10 minutos y se lavaron tres veces con DPBS para eliminar el exceso de fijador. La permeabilización se realizó utilizando un 0,1% de Triton X-100 en PBS durante 5 minutos para permitir el acceso a los objetivos intracelulares. Se realizaron lavados adicionales con DPBS, después de lo cual se bloqueó la unión inespecífica incubando las células con un 2% de albúmina sérica bovina (BSA) en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Se utilizó un microscopio confocal de alta resolución (Eviden [Olympus] SpinSR, Japón) con un objetivo de inmersión en aceite de 60× para la imagen de fluorescencia. El sistema utiliza excitaciones láser a 405, 488, 561 y 640 nm para permitir la detección de fluorescencia multicanal para la visualización precisa de las estructuras celulares y la localización de los compuestos.

Citometría de flujo

Para medir la captación celular, se sembraron células a 1 × 105 células por pocillo en placas de 24 pocillos y se les permitió adherirse durante la noche en condiciones de cultivo estándar. Al día siguiente, las células se lavaron y se añadió 1 mL de medio de crecimiento fresco que contenía nanopartículas de ARN marcadas con Cy5 a una concentración de 10 μL/mL (20 nM). Las formulaciones examinadas fueron PLA-KA26-ARN@Cy5, PLA-RGD-KA26-ARN@Cy5, PLA-WA30-ARN@Cy5 y PLA-RGD-WA30-ARN@Cy5. Para una comparación justa, cada formulación contenía la misma cantidad de ARN marcado con Cy5. Después de 4 horas de incubación, las células se lavaron tres veces con PBS para eliminar cualquier nanopartícula restante. Las células se recogieron luego y se analizaron mediante citometría de flujo utilizando un instrumento CytoFLEX (Beckman Coulter). Durante el análisis, se seleccionaron cuidadosamente las poblaciones de células individuales y solo se incluyeron las células viables en la cuantificación. Se utilizó el software FlowJo para evaluar la señal de fluorescencia interna, proporcionando una evaluación cuantitativa de la captación de ARN marcado con Cy5 para cada formulación de nanopartículas.

Transfección de siRNA

Las células CT-26 (1 × 105 células/pocillo) se cultivaron en placas de 6 pocillos durante 24 horas. Los siARN y jetPRIME se mezclaron para preparar el reactivo de transfección según las instrucciones del fabricante. Las soluciones mezcladas se añadieron luego a cada pocillo, y la concentración final de siARN se fijó en 100 nM; el control negativo (NC) también se transfectó simultáneamente (Tabla 2). Las células se cultivaron luego durante otras 24 horas y se sometieron a inmunotransferencia para verificar la eficiencia de la transfección. Las células transfectadas con éxito se utilizaron en experimentos posteriores.

Citotoxicidad de las formulaciones

Las células CT-26 se cultivaron en medio de cultivo RPMI-1640 suplementado con un 10% de FBS y un 1% de penicilina/estreptomicina en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO2. Para evaluar la citotoxicidad de PLA, las células CT-26 se sembraron en placas de 96 pocillos (5 × 103 células por pocillo) bajo una humedad del 100% y se cultivaron a 37 °C con un 5% de CO2. Después de 24 horas, las células se incubaron con diferentes concentraciones de compuestos de PLA durante otras 48 horas y se analizaron para determinar su viabilidad. Se añadió solución CCK-8 (10 μL, 2 mg/mL) a cada pocillo y, después de 2 horas, se midió la densidad óptica (DO) a 450 nm utilizando un lector de microplacas. Los resultados se calcularon y se analizaron estadísticamente utilizando la siguiente fórmula: Viabilidad celular (%) = [(DO experimental - DO del control en blanco) / (DO del control negativo - DO del control en blanco)] × 100%

Líneas celulares y reactivos

Cultivo celular: Las células CT-26 se obtuvieron de Guangzhou ELGBIO Biotechnology Co. Ltd., y las células CT-26-luc se compraron a Wuhan Warner Bio (Wuhan) Co. Ltd. Las células HCT-116, MC38 y RKO se obtuvieron de ORiCells Biotechnology Co. Ltd. (Shanghái). Las células adherentes se cultivaron en placas de 10 cm a 37 °C en una atmósfera humidificada con un 5% de CO2. Todas las células se cultivaron en DMEM/RPMI-1640 suplementado con un 10% de FBS y un 1% de penicilina/estreptomicina.

Análisis de qPCR en tiempo real

Se utilizaron células de cáncer colorrectal CT-26 y HCT-116 para evaluar la expresión génica tras el tratamiento con nanopartículas de PLA-RGD-KA26-ARN in vitro. Primero, se contaron las células utilizando un contador de células automatizado y, a continuación, se resuspensionaron en un medio de cultivo completo. Cada tipo de célula se sembró en placas de 12 pocillos a una densidad de 3 × 105 células por pocillo en 1 ml de medio y se incubó durante aproximadamente 24 h en una incubadora humidificada al 5% de CO2 a 37 °C para permitir la adhesión y recuperación de las células. Al día siguiente, las células se trataron con 10 μL de nanopartículas de PLA-RGD-KA26-ARN por pocillo. Se ajustó la cantidad de ARN según fuera necesario. Se añadió un volumen igual de PBS al grupo control. Todos los experimentos se realizaron tres veces (n = 3) para garantizar la reproducibilidad de los resultados. Las células se mantuvieron en las formulaciones durante 36 h en condiciones normales. Las células de cada pocillo se transfirieron a tubos Eppendorf de 1,5 ml libres de RNasa después de la incubación. Las muestras se centrifugaron a 5000 rpm durante 5 min y se descartaron los sobrenadantes. Los sedimentos se lavaron con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) estéril y se centrifugaron de nuevo de la misma manera. Para iniciar la extracción de ARN, se añadió 1 ml de TRIzol a cada sedimento celular. Las células se pipetearon suavemente de nuevo en la mezcla para lisarlas y los tubos se colocaron en hielo durante 10 min. A continuación, se añadió 200 μL de cloroformo a cada tubo y se mezcló durante 15 s. Después de 10 min en hielo, los tubos se centrifugaron a 12.000 × g durante 10 min a 4 °C. La mezcla se separó en tres capas: la fase acuosa superior (ARN), la fase intermedia (proteína) y la fase orgánica inferior (ADN). La capa superior se colocó cuidadosamente en tubos nuevos preenfriados libres de RNasa. Se añadieron volúmenes iguales de isopropanol al ARN, se mezcló suavemente y se incubó en hielo durante 10 min. Los tubos se centrifugaron a 12.000 × g durante 10 min a 4 °C. Un sedimento blanco indicó una precipitación exitosa del ARN. Se descartaron los sobrenadantes y los sedimentos se lavaron con 75% de etanol frío. Las muestras se centrifugaron de nuevo durante 5 min después de una suave resuspensión mediante golpecitos. Se eliminó el etanol y se dejó que el ARN se secara al aire durante 3-5 min. Finalmente, se añadió 50 μL de agua libre de RNasa a cada muestra para la elución. Se utilizó un espectrofotómetro Nano Drop (Thermo Fisher Scientific) para medir la pureza y la concentración del ARN. Las muestras se almacenaron a -80 °C hasta su uso posterior.

Para la síntesis de ADN complementario (cADN), se transcribió en sentido inverso 2 μg de ARN purificado por muestra utilizando un kit de transcripción inversa disponible comercialmente, siguiendo el protocolo del fabricante. El cADN sintetizado se utilizó posteriormente para el análisis de PCR cuantitativa (qPCR) utilizando el Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix. Cada gen se analizó por triplicado y las reacciones se realizaron en un sistema Roche LightCycler® 96 bajo condiciones estándar de ciclismo térmico. β-ACTINA sirvió como control interno para la normalización. Las secuencias de todos los cebadores utilizados para la amplificación se muestran en la Tabla 1, Tabla 1.

Utilizando NSUN2 como ejemplo, la diferencia entre el grupo experimental y el grupo control se calculó utilizando las siguientes fórmulas.

Western blot

Las células adheridas se cultivaron en placas de 6 pocillos y se dejaron alcanzar aproximadamente el 70% de confluencia para experimentos de 24 h o el 50% de confluencia para experimentos de 48 h. El tratamiento con cualquiera de las formulaciones se realizó directamente en un medio de cultivo completo. En los puntos temporales indicados, las células se lavaron suavemente tres veces con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) para eliminar el medio residual y los reactivos no unidos. La lisis celular se realizó sobre hielo durante 30 min utilizando un tampón RIPA suplementado con un cóctel de inhibidores de proteasas (Roche), un cóctel de inhibidores de fosfatasas (Cell Signalling Technology) y un 0,1% de Benzonase (Millipore-Sigma) para garantizar una extracción eficiente de proteínas y la degradación de los ácidos nucleicos. Después de la lisis, las muestras se centrifugaron a 20.000 × g durante 20 min a 4 °C para eliminar los restos celulares. Las concentraciones de proteína en los lisados aclarados se cuantificaron utilizando el ensayo BCA. Cargamos concentraciones iguales de proteína total en geles de Bis-Tris al 4-12% y realizamos SDS-PAGE. A continuación, las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF siguiendo las instrucciones del fabricante. Para bloquear la unión inespecífica, las membranas se incubaron en un 5% de leche descremada preparada en tampón Tris (TBS) durante 1 h a temperatura ambiente. Después del bloqueo, los anticuerpos primarios se diluyeron en el mismo tampón y las membranas se incubaron durante la noche a 4 °C con los anticuerpos primarios dirigidos a la proteína diana. Al día siguiente, la membrana se lavó tres veces con TBS que contiene un 0,1% de Tween-20 (TBS-T). A continuación, añadimos el anticuerpo secundario y lo incubamos durante 1-2 h a temperatura ambiente. Esto fue seguido por tres lavados adicionales con TBS-T. Las señales de proteína se detectaron utilizando un sistema de imagen ChemiDoc Touch (Bio-Rad).

Ensayo de migración Transwell

Para evaluar la influencia de los diversos tratamientos sobre la migración celular, utilizamos ensayos Transwell para estudiar el efecto de los diferentes tratamientos sobre la migración celular en las líneas celulares de cáncer colorrectal CT-26 y HCT-116. Primero, cultivamos las células durante al menos 24 h y confirmamos su crecimiento. A continuación, las células se trataron con tripsina, se contaron utilizando un contador de células automatizado y se resuspendieron en RPMI o DMEM sin suero, según la línea celular. Utilizamos cámaras Transwell de 6 pocillos con una membrana de policarbonato de 8 μm de tamaño de poro (Corning, EE. UU.) y las colocamos en placas de cultivo de 6 pocillos. Los insertos se pretrataron con medio sin suero y se incubaron a 37 °C durante 30 min antes de la siembra. Este paso aseguró una hidratación adecuada de la membrana y apoyó una eficiente adhesión de las células a la membrana. Para cada pocillo, se añadieron cuidadosamente 1 × 105 células en 200 μL de medio sin suero a la cámara superior. La cámara inferior contenía 600 μL de medio completo preparado con un 10% de FBS, que sirvió como quimioatrayente. Para los grupos de tratamiento, se añadieron nanopartículas de PLA-RGD-KA26-ARN (PRR) o PLA-KA26-ARN (PR) directamente a la cámara superior junto con las células (10 μL cada una). El grupo control recibió un volumen igual de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Las células se incubaron a 37 °C con un 5% de CO2 durante 24-48 h. Después de la incubación, las células no migradas restantes en el lado superior de la membrana se eliminaron cuidadosamente utilizando un hisopo de algodón estéril. Los insertos se lavaron con PBS para eliminar los restos. Las células migradas se fijaron en el lado inferior de la membrana con un 4% de paraformaldehído durante 15 min a temperatura ambiente y se tiñeron con un 0,5% de cristal violeta durante 20 min, como se describió anteriormente. Se eliminó el exceso de tinte enjuagando con agua destilada y las membranas se dejaron secar al aire.

Las células migradas se visualizaron utilizando un microscopio de contraste de fase invertido (Olympus, Tokio, Japón) a un aumento de 10× o 20×. Se capturaron imágenes de cinco campos seleccionados aleatoriamente por pocillo. El recuento de células se realizó manualmente utilizando ImageJ o un software de recuento de células automatizado, según esté disponible. Todos los experimentos se realizaron por triplicado para garantizar la consistencia y la solidez estadística. Los datos se expresan como el número medio de células migradas por campo o como un porcentaje en relación con los controles no tratados.

Ensayo de curación de arañazos

Realizamos ensayos de arañazos (curación de heridas) para estudiar los efectos de la expresión de NSUN2 y el tratamiento con nanopartículas sobre la migración de las células de cáncer colorrectal CT-26. Se utilizaron células CT-26 de tipo salvaje y células diseñadas para sobreexpresar NSUN2 en este estudio. Sembró 5 × 105 células por pocillo en placas de 6 pocillos en un medio completo de RPMI-1640 con un 10% de FBS. Las células se incubaron durante la noche a 37 °C en una incubadora humidificada con un 5% de CO2. Una vez que las células alcanzaron una confluencia del 90-100%, se creó un arañazo uniforme en el centro de cada pocillo utilizando una punta de pipeta estéril de 200 μL. Los pocillos se lavaron dos veces con PBS para eliminar las células desprendidas y los restos. A continuación, añadimos las formulaciones de nanopartículas PRR y PR al medio a una concentración final de ARN de 10 μL/mL. En otro experimento, evaluamos los efectos terapéuticos de las células CT-26 que sobreexpresan NSUN2. Los grupos de control incluyeron células de tipo salvaje no tratadas y células que sobreexpresan NSUN2 tratadas solo con PBS. Todos los experimentos se realizaron por triplicado para garantizar la reproducibilidad. Las células tratadas se mantuvieron en condiciones estándar y se observó su capacidad para migrar hacia el área arañada. Se capturaron imágenes a 0 h (inmediatamente después del arañazo), 12 h, 24 h, 48 h y 72 h utilizando un microscopio de contraste de fase invertido (Olympus, Japón). Se obtuvieron imágenes de múltiples campos en cada pocillo para garantizar la consistencia de los resultados. Medimos el ancho del arañazo en cada punto temporal utilizando el software ImageJ.

La tasa de curación se calculó utilizando la siguiente fórmula:

Cierre de la brecha (%) = [(Ancho a 0 h - Ancho a X h) / Ancho a 0 h] × 100.

Evaluación in vivo de la biodistribución y la administración de fármacos

La biodistribución in vivo y la eficiencia de direccionamiento tumoral de las formulaciones de nanopartículas se evaluaron utilizando la imagen de todo el cuerpo en tiempo real y la imagen ex vivo de fluorescencia con nanopartículas cargadas de ARN marcadas con Cy5. Para establecer un modelo de metástasis pulmonar, se inyectaron por vía intravenosa en la vena de la cola ratones hembra BALB/c (de 6 a 8 semanas de edad) con 1,5 × 106 células CT-26-luc por ratón. Después de permitir que los tumores se desarrollaran durante 10 días, los ratones se dividieron aleatoriamente en dos grupos (n = 3 por grupo) para los análisis comparativos. Las dos formulaciones utilizadas fueron PLA-KA26-ARN@Cy5 (PR@cy5), nanopartículas no dirigidas, y PLA-RGD-KA26-ARN@Cy5 (PRR@cy5), nanopartículas dirigidas a RGD para el direccionamiento tumoral activo. Cada ratón recibió una inyección intravenosa (vena de la cola) de 100 μL de cualquiera de las formulaciones que contenían una dosis equivalente de 2 μg/g de siRNA marcado con Cy5. Se realizó una imagen de fluorescencia de todo el cuerpo utilizando un sistema de imagen in vivo (sistema de imagen Xenogen IVIS 200) en varios puntos temporales posteriores a la inyección: 0 h, 4 h, 12 h, 24 h y 48 h. Los ratones se anestesiaron con isoflurano y se colocaron en una cámara de imagen para la imagen. La fluorescencia de Cy5 se detectó utilizando los filtros de excitación (640 nm) y emisión (680 nm) adecuados. Se definieron regiones de interés (ROI) sobre el área torácica (pulmones) y se cuantificaron las intensidades de fluorescencia utilizando el software del instrumento. Las señales de la ROI se expresaron como fotones por segundo por centímetro cuadrado por estereorradián (ph/s/cm2/sr). A las 48 h, se recolectaron los órganos principales, incluidos el corazón, el hígado, el bazo, los pulmones, los riñones y los tejidos tumorales, para la imagen de fluorescencia ex vivo. Se definieron regiones de interés (ROI) y se cuantificó la intensidad de fluorescencia utilizando el software V3Vision. Esto permitió la evaluación de los perfiles de biodistribución de ambas formulaciones dirigidas y no dirigidas. La intensidad de fluorescencia de cada órgano se cuantificó utilizando el mismo método de análisis de la ROI. Los datos se presentan como la señal de fluorescencia media ± DE.

Biocompatibilidad in vivo

Para evaluar la toxicidad sistémica aguda y tardía, se inyectaron por vía intravenosa ratones hembra BALB/c inmunocompetentes con PBS, RR, PRR o PRRP cada tres días a una dosis de 2 μg/g de peso corporal de siRNA durante seis inyecciones. El día 14, después de la administración final de las formulaciones, se sacrificaron los ratones y se recolectaron muestras de sangre para los análisis hematológicos y bioquímicos. Se recolectaron órganos para el examen histopatológico. Las muestras de sangre se recolectaron en tubos Microvette 100 K3E de potasio-EDTA (Sarstedt) para el hemograma completo y se analizaron por Hangzhou Haoke Biotechnology Co., Ltd. Se recolectó sangre en tubos sin anticoagulantes para los análisis de química sérica. Los parámetros bioquímicos se cuantificaron utilizando kits de reactivos Fuji DRI-CHEM SLIDE combinados con un analizador de química seca Fuji NX500i.

Animales y tumores sinérgicos

Para el establecimiento de un modelo murino de metástasis pulmonar, se seleccionaron ratones hembra BALB/c de 6 a 8 semanas de edad (con un peso de 18 a 22 g) para los fines de la investigación. Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las directrices institucionales para el cuidado de los animales y fueron aprobados por el Comité correspondiente de Cuidado y Uso de Animales. La línea celular murina de cáncer de colon CT-26-luc se cultivó en medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 enriquecido con un 10% de suero bovino fetal (FBS), un 1% de penicilina-estreptomicina y 150 μg/mL de G418 para mantener la actividad de la luciferasa. Las células se cultivaron en condiciones estándar (37 °C, 5% de CO2) y se recolectaron durante la fase de crecimiento exponencial para evaluar la viabilidad. Para establecer el modelo, a cada ratón se le inyectó por vía intravenosa 1,5 × 106 células CT-26-luc suspendidas en 100 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) estéril a través de la vena de la cola. Este método mejora la circulación sistémica y permite una colonización precisa del tejido pulmonar, imitando eficazmente la diseminación metastásica. Se realizó una imagen de bioluminiscencia (BLI) utilizando un sistema de imagen Xenogen IVIS 200 (PerkinElmer, EE. UU.) para observar la formación de tumores y evaluar la progresión metastásica. Los ratones se escanearon en varios intervalos de tiempo (días 0, 10, 20 y 28) después de la inyección de células tumorales. Se administró D-luciferina por vía intraperitoneal a una dosis de 150 mg/kg, disuelta en PBS estéril, antes de la imagen. Después de un período de incubación de 10 minutos para facilitar la distribución sistémica del sustrato, los ratones fueron sedados con un 2% de isoflurano y colocados en la sala de imagen. La luminiscencia se registró con una duración de exposición de 1 a 5 minutos, utilizando configuraciones adecuadas para el campo de visión, la apertura y el agrupamiento. Las regiones de interés (ROI) se delimitaron manualmente alrededor del área torácica para evaluar las señales tumorales específicas de los pulmones. La intensidad de la señal se midió en fotones por segundo por centímetro cuadrado por estereorradián (ph/s/cm2/sr) utilizando el software V3Vision. Se incluyó un mínimo de tres ratones en cada grupo de tratamiento (n = 3), y la progresión tumoral se evaluó longitudinalmente a lo largo del estudio. Los resultados de la imagen se utilizaron para evaluar la extensión de la metástasis y la eficacia del tratamiento posterior con composiciones de nanopartículas específicas del tumor.

Inmunofluorescencia tisular

Los especímenes de tejido recién extraídos se conservaron en un 4% de paraformaldehído a 4 °C durante 2 horas para mantener la arquitectura celular. Después de la fijación, los tejidos se lavaron meticulosamente con PBS y se crioprotegieron durante la noche a 4 °C en una solución de sacarosa al 30% formulada con PBS para evitar la formación de cristales de hielo durante la congelación. Al día siguiente, los tejidos se incluyeron en un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) y se almacenaron a -80 °C hasta el corte. Se prepararon criosecciones con un grosor de 8 μm utilizando un criostato mantenido entre -20 °C y -25 °C. Después del corte, las secciones de tejido se secaron al aire y luego se fijaron en acetona fría (preenfriada a -20 °C) durante 10 minutos para mejorar la preservación del antígeno. Después de la fijación, las láminas se enjuagaron con PBS para eliminar el exceso de acetona. Para la tinción de inmunofluorescencia, las secciones se lavaron brevemente con un 5% de BSA en TBST (TBS + 0,1% de Tween-20), seguido de un bloqueo con este tampón durante 1 hora a temperatura ambiente para reducir la unión inespecífica. Las proteínas unidas se lavaron cuatro veces con 1% de BSA/TBST durante 5 minutos y se enjuagaron dos veces con PBS para eliminar el detergente residual. Las secciones se incubaron con anticuerpos primarios en 1% de BSA/TBST (100 μL por muestra) durante la noche a 4 °C en una cámara humidificada. Al día siguiente, el exceso de anticuerpo se eliminó lavando con cuatro lavados suaves de 1% de BSA/TBST, seguidos de dos enjuagues con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Después de lavar la placa tres veces con 30 μL de WSB por pocillo, se agregaron anticuerpos secundarios directamente en la oscuridad y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Para visualizar los núcleos, se realizó una tinción con DAPI utilizando el colorante (diluido en 1% de BSA/TBST) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de los lavados finales (al menos cuatro ciclos con 1% de BSA/TBST y PBS), las secciones de tejido se secaron al aire en la oscuridad. Se agregó una gota (20 μL) de un medio de montaje antifade a cada lámina y se colocaron suavemente los cubreobjetos y se sellaron con esmalte de uñas transparente para preservar las señales de fluorescencia. Para detectar las células apoptóticas, se realizó un ensayo TUNEL utilizando un kit comercialmente disponible (KeyGEN Biotech, Nanjing, China) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para este ensayo, las secciones se desparafinizaron. Todos los tejidos teñidos se visualizaron bajo un microscopio de fluorescencia Zeiss, y se realizó un análisis cuantitativo, incluido el recuento de células teñidas positivamente y las mediciones de la intensidad media de fluorescencia, utilizando el software ImageJ.

Tinción con hematoxilina y eosina (H&E)

La tinción con H&E se realizó en secciones de 3 μm de espesor de tejidos FFPE. Las láminas se incubaron durante la noche a 58 °C para la desparafinización y para garantizar la adhesión y fusión tradicionales de la parafina. Las láminas se desparafinizaron con xileno y se rehidrataron con lavados secuenciales de etanol de 5 minutos (100% seguido de 70%). Las láminas se enjuagaron con agua destilada al día siguiente. Los tejidos recuperados se cortaron en secciones transversales y se tiñeron con hematoxilina y eosina según el procedimiento estándar. Las láminas teñidas se visualizaron utilizando un microscopio de escaneo de láminas OLYMPUS VS200 a alto aumento para extraer datos histológicos detallados.

Análisis estadístico

Se utilizó GraphPad Prism versión 8.0 para el análisis estadístico utilizando una prueba de Student de dos colas. Se utilizó un nivel de significación de p < 0,05 para todos los experimentos. En las figuras, las diferencias estadísticamente significativas se denotan de la siguiente manera: p < 0,05 (*), p < 0,01 () y p < 0,001 (*).

Preparación de poliplexos y nanocomplejos

Para formar los poliplexos, el siRNA se diluyó en agua libre de ARN hasta una concentración final de 40 ng/μL y se mezcló con péptidos KA26 (KKALLAHALHLLALLALHLAHALKKA)/WA30 (WEARLARALARALARHLARALARALRACEA) (GL Biochem, Shanghái, China) a una concentración de 800 ng/μL. El poli(ácido láctico) (PLA) se disolvió primero en diclorometano y luego el disolvente se evaporó utilizando un evaporador rotatorio. La película de PLA resultante se dispersó en agua para obtener nanopartículas de PLA (PLA NPs). Se mezclaron volúmenes iguales de poliplexos de péptido/siRNA y PLA-NPs (0,5% p/v en agua; Millipore, Bedford, MA, EE. UU.) para formar nanocomplejos de PLA-NP/péptido/siRNA. Para los nanocomplejos funcionalizados con RGD, el PLA y los péptidos RGD se disolvieron conjuntamente en diclorometano, se evaporaron utilizando un evaporador rotatorio, se dispersaron en agua y luego se liofilizaron. Las nanopartículas de PLA funcionalizadas con RGD liofilizadas se reconstituieron en agua, y se mezclaron volúmenes iguales con poliplexos de péptido/siRNA para formar nanocomplejos de PLA-RGD/péptido/siRNA. El diámetro hidrodinámico y el potencial zeta (carga superficial) de las formulaciones de ARN resultantes se midieron mediante dispersión dinámica de luz (DLS) utilizando un Malvern ZetaSizer Pro (Malvern Instruments, Reino Unido).

Estabilidad de las formulaciones

Se realizó un estudio de estabilidad para investigar los cambios temporales en las propiedades fisicoquímicas y la actividad biológica de las formulaciones de poliplexos y nanocomplejos. Los complejos se almacenaron en refrigeración (4 °C) durante 7 días. A intervalos regulares, se midieron el diámetro hidrodinámico y el potencial zeta utilizando la dispersión dinámica de luz (DLS) con un Malvern ZetaSizer Pro (Malvern Instruments, Reino Unido).

Eficiencia de expresión y captación celular

Para preparar los estudios de imagen, las células adherentes se sembraron un día antes y alcanzaron aproximadamente el 70% de confluencia en el grupo de tratamiento de 24 horas. Se agregó medio de crecimiento completo (1 mL) a cada pocillo, y se agregaron los compuestos a base de PLA que contienen RNA-Cy5 (20 nM) u otras formulaciones de control apropiadas a cada pocillo. Luego, las células se incubaron con la formulación durante el período de tiempo designado. Después del período de tiempo deseado, las células se lavaron suavemente con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) para eliminar cualquier formulación restante. Se realizó una tinción nuclear con DAPI durante 15 minutos a temperatura ambiente según las instrucciones del fabricante. Luego, las células se fijaron con un 4% de paraformaldehído en PBS durante 10 minutos y se lavaron tres veces con DPBS para eliminar el exceso de fijador. La permeabilización se realizó utilizando un 0,1% de Triton X-100 en PBS durante 5 minutos para permitir el acceso a los objetivos intracelulares. Se realizaron lavados adicionales con DPBS, después de lo cual se bloqueó la unión inespecífica incubando las células con un 2% de albúmina sérica bovina (BSA) en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Las proteínas unidas se lavaron cuatro veces con 1% de BSA/TBST durante 5 minutos y se enjuagaron dos veces con PBS para eliminar el detergente residual. Las secciones se incubaron con anticuerpos primarios en 1% de BSA/TBST (100 μL por muestra) durante la noche a 4 °C en una cámara humidificada. Al día siguiente, el exceso de anticuerpo se eliminó lavando con cuatro lavados suaves de 1% de BSA/TBST, seguidos de dos enjuagues con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Después de lavar la placa tres veces con 30 μL de WSB por pocillo, se agregaron anticuerpos secundarios directamente en la oscuridad y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Para visualizar los núcleos, se realizó una tinción con DAPI utilizando el colorante (diluido en 1% de BSA/TBST) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de los lavados finales (al menos cuatro ciclos con 1% de BSA/TBST y PBS), las secciones de tejido se secaron al aire en la oscuridad. Se agregó una gota (20 μL) de un medio de montaje antifade a cada lámina y se colocaron suavemente los cubreobjetos y se sellaron con esmalte de uñas transparente para preservar las señales de fluorescencia. Para detectar las células apoptóticas, se realizó un ensayo TUNEL utilizando un kit comercialmente disponible (KeyGEN Biotech, Nanjing, China) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para este ensayo, las secciones se desparafinizaron. Todos los tejidos teñidos se visualizaron bajo un microscopio de fluorescencia Zeiss, y se realizó un análisis cuantitativo, incluido el recuento de células teñidas positivamente y las mediciones de la intensidad media de fluorescencia, utilizando el software ImageJ.

Citometría de flujo

Para medir la captación celular, las células se sembraron a 1 × 105 células por pocillo en placas de 24 pocillos y se dejaron adherir durante la noche en condiciones de cultivo estándar. Al día siguiente, las células se lavaron y se agregó 1 mL de medio de crecimiento fresco que contenía nanopartículas de RNA marcadas con Cy5 a una concentración de 10 μL/mL (20 nM). Las formulaciones examinadas fueron PLA-KA26-RNA@Cy5, PLA-RGD-KA26-RNA@Cy5, PLA-WA30-RNA@Cy5 y PLA-RGD-WA30-RNA@Cy5. Para una comparación justa, cada formulación contenía la misma cantidad de RNA marcado con Cy5. Después de 4 horas de incubación, las células se lavaron tres veces con PBS para eliminar cualquier nanopartícula restante. Luego, las células se recolectaron y se analizaron mediante citometría de flujo utilizando un instrumento CytoFLEX (Beckman Coulter). Durante el análisis, se seleccionaron cuidadosamente poblaciones de células individuales y solo se incluyeron las células viables en la cuantificación. Se utilizó el software FlowJo para evaluar la señal de fluorescencia interna, proporcionando una evaluación cuantitativa de la captación de RNA marcado con Cy5 para cada formulación de nanopartículas.

Transfección de siRNA

Las células CT-26 (1 × 105 células/pocillo) se cultivaron en placas de 6 pocillos durante 24 horas. Los siRNA y jetPRIME se mezclaron para preparar el reactivo de transfección según las instrucciones del fabricante. Luego, las soluciones mezcladas se agregaron a cada pocillo, y la concentración final de siRNA se estableció en 100 nM; el control negativo (NC) también se transfectó simultáneamente (Tabla 2). Las células se cultivaron durante otras 24 horas y se sometieron a inmunotransferencia para verificar la eficiencia de la transfección. Las células transfectadas con éxito se utilizaron en experimentos posteriores.

Citotoxicidad de las formulaciones

Las células CT-26 se cultivaron en medio de cultivo RPMI-1640 suplementado con un 10% de FBS y un 1% de penicilina/estreptomicina en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO2. Para evaluar la citotoxicidad del PLA, las células CT-26 se sembraron en placas de 96 pocillos (5 × 103 células por pocillo) bajo una humedad del 100% y se cultivaron a 37 °C con un 5% de CO2. Después de 24 horas, las células se incubaron con diferentes concentraciones de compuestos de PLA durante 48 horas adicionales y se analizaron para determinar su viabilidad. Se agregó solución CCK-8 (10 μL, 2 mg/mL) a cada pocillo, y después de 2 horas, se midió la densidad óptica (OD) a 450 nm utilizando un lector de microplacas. Los resultados se calcularon y se analizaron estadísticamente utilizando la siguiente fórmula: Viabilidad celular (%) = [(OD experimental - OD control en blanco) / (OD control negativo - OD control en blanco)] × 100%

Líneas celulares y reactivos

Cultivo celular: Las células CT-26 se obtuvieron de Guangzhou ELGBIO Biotechnology Co. Ltd., y las células CT-26-luc se compraron a Wuhan Warner Bio (Wuhan) Co. Ltd. Las células HCT-116, MC38 y RKO se obtuvieron de ORiCells Biotechnology Co. Ltd. (Shanghái). Las células adherentes se cultivaron en placas de 10 cm a 37 °C en una atmósfera humidificada con un 5% de CO2. Todas las células se cultivaron en DMEM/RPMI-1640 suplementado con un 10% de FBS y un 1% de penicilina/estreptomicina.

Análisis de qPCR en tiempo real

Se utilizaron células de cáncer colorrectal CT-26 y HCT-116 para evaluar la expresión génica tras el tratamiento con nanopartículas PLA-RGD-KA26-RNA in vitro. Primero, se contaron las células utilizando un contador de células automatizado y, a continuación, se resuspensionaron en un medio de cultivo completo. Cada tipo de célula se sembró en placas de 12 pocillos a una densidad de 3 × 105 células por pocillo en 1 ml de medio y se incubó durante aproximadamente 24 h en una incubadora humidificada a 37 °C con 5 % de CO2 para permitir la adhesión y recuperación de las células. Al día siguiente, las células se trataron con 10 μl de nanopartículas PLA-RGD-KA26-RNA por pocillo. Se ajustó la cantidad de ARN según fuera necesario. Se añadió un volumen igual de PBS al grupo control. Todos los experimentos se realizaron tres veces (n = 3) para garantizar la reproducibilidad de los resultados. Las células se mantuvieron en las formulaciones durante 36 h en condiciones normales. Las células de cada pocillo se transfirieron a tubos Eppendorf de 1,5 ml libres de RNasa después de la incubación. Las muestras se centrifugaron a 5000 rpm durante 5 min y se descartaron los sobrenadantes. Los sedimentos se lavaron con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) estéril y se centrifugaron de nuevo de la misma manera. Para iniciar la extracción de ARN, se añadió 1 ml de TRIzol a cada sedimento celular. Las células se pipetearon suavemente de nuevo en la mezcla para lisarlas y los tubos se colocaron en hielo durante 10 min. A continuación, se añadió 200 μl de cloroformo a cada tubo y se mezcló durante 15 s. Después de 10 min en hielo, los tubos se centrifugaron a 12.000 × g durante 10 min a 4 °C. La mezcla se separó en tres capas: la fase acuosa superior (ARN), la fase intermedia (proteína) y la fase orgánica inferior (ADN). La capa superior se colocó cuidadosamente en tubos nuevos preenfriados libres de RNasa. Se añadieron volúmenes iguales de isopropanol al ARN, se mezcló suavemente y se incubó en hielo durante 10 min. Los tubos se centrifugaron a 12.000 × g durante 10 min a 4 °C. Un sedimento blanco indicó una precipitación exitosa del ARN. Se descartaron los sobrenadantes y los sedimentos se lavaron con 75 % de etanol frío. Las muestras se centrifugaron de nuevo durante 5 min después de una suave resuspensión mediante golpecitos. Se eliminó el etanol y se dejó que el ARN se secara al aire durante 3 a 5 min. Finalmente, se añadió 50 μl de agua libre de RNasa a cada muestra para la elución. Se utilizó un espectrofotómetro Nano Drop (Thermo Fisher Scientific) para medir la pureza y la concentración del ARN. Las muestras se almacenaron a -80 °C hasta su uso posterior.

Para la síntesis de ADN complementario (cADN), se transcribió en sentido inverso 2 μg de ARN purificado por muestra utilizando un kit de transcripción inversa disponible comercialmente, siguiendo el protocolo del fabricante. El cADN sintetizado se utilizó posteriormente para el análisis de PCR cuantitativa (qPCR) utilizando el Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix. Cada gen se analizó por triplicado y las reacciones se realizaron en un sistema Roche LightCycler® 96 bajo condiciones estándar de ciclaje térmico. La β-ACTINA sirvió como control interno para la normalización. Las secuencias de todos los cebadores utilizados para la amplificación se muestran en la Tabla 1, Tabla 1.

Utilizando NSUN2 como ejemplo, la diferencia entre el grupo experimental y el grupo control se calculó utilizando las siguientes fórmulas.

Western blot

Las células adheridas se cultivaron en placas de 6 pocillos y se dejaron alcanzar aproximadamente el 70 % de confluencia para experimentos de 24 h o el 50 % de confluencia para experimentos de 48 h. El tratamiento con cualquiera de las formulaciones se realizó directamente en un medio de cultivo completo. En los puntos temporales indicados, las células se lavaron suavemente tres veces con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) para eliminar el medio residual y los reactivos no unidos. La lisis celular se realizó sobre hielo durante 30 min utilizando un tampón RIPA suplementado con un cóctel de inhibidores de proteasas (Roche), un cóctel de inhibidores de fosfatasas (Cell Signalling Technology) y un 0,1 % de Benzonase (Millipore-Sigma) para garantizar una extracción eficiente de proteínas y la degradación de los ácidos nucleicos. Tras la lisis, las muestras se centrifugaron a 20.000 × g durante 20 min a 4 °C para eliminar los restos celulares. Las concentraciones de proteína en los lisados aclarados se cuantificaron utilizando el ensayo BCA. Cargamos concentraciones iguales de proteína total en geles de Bis-Tris al 4-12 % y realizamos SDS-PAGE. A continuación, las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF siguiendo las instrucciones del fabricante. Para bloquear la unión inespecífica, las membranas se incubaron en un 5 % de leche descremada preparada en tampón Tris (TBS) durante 1 h a temperatura ambiente. Después del bloqueo, los anticuerpos primarios se diluyeron en el mismo tampón y las membranas se incubaron durante la noche a 4 °C con los anticuerpos primarios dirigidos a la proteína diana. Al día siguiente, la membrana se lavó tres veces con TBS que contenía un 0,1 % de Tween-20 (TBS-T). A continuación, añadimos el anticuerpo secundario y lo incubamos durante 1 a 2 h a temperatura ambiente. A continuación, se realizaron tres lavados adicionales con TBS-T. Las señales de las proteínas se detectaron utilizando un sistema de imagen ChemiDoc Touch (Bio-Rad).

Ensayo de migración Transwell

Para evaluar la influencia de los diversos tratamientos sobre la migración celular, utilizamos ensayos Transwell para estudiar el efecto de los diferentes tratamientos sobre la migración celular en las líneas celulares de cáncer colorrectal CT-26 y HCT-116. Primero, cultivamos las células durante al menos 24 h y confirmamos su crecimiento. A continuación, las células se trataron con tripsina, se contaron utilizando un contador de células automatizado y se resuspendieron en RPMI o DMEM sin suero, según la línea celular. Utilizamos cámaras Transwell de 6 pocillos con una membrana de policarbonato de 8 μm de tamaño de poro (Corning, EE. UU.) y las colocamos en placas de cultivo de 6 pocillos. Los insertos se pretrataron con medio sin suero y se incubaron a 37 °C durante 30 min antes de la siembra. Este paso garantizó una hidratación adecuada de la membrana y favoreció la unión eficiente de las células a la membrana. Para cada pocillo, se añadieron cuidadosamente 1 × 105 células en 200 μl de medio sin suero a la cámara superior. La cámara inferior contenía 600 μl de medio completo preparado con un 10 % de FBS, que sirvió como agente quimioatractivo. Para los grupos de tratamiento, se añadieron nanopartículas PLA-RGD-KA26-RNA (PRR) o PLA-KA26-RNA (PR) directamente a la cámara superior junto con las células (10 μl cada una). El grupo control recibió un volumen igual de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Las células se incubaron a 37 °C con un 5 % de CO2 durante 24 a 48 h. Después de la incubación, las células no migradas restantes en la parte superior de la membrana se eliminaron cuidadosamente utilizando un hisopo de algodón estéril. Los insertos se lavaron con PBS para eliminar los restos. Las células migradas se fijaron en la parte inferior de la membrana con un 4 % de paraformaldehído durante 15 min a temperatura ambiente y se tiñeron con un 0,5 % de cristal violeta durante 20 min, como se describió anteriormente. Se eliminó el exceso de tinte enjuagando con agua destilada y las membranas se secaron al aire.

Las células migradas se visualizaron utilizando un microscopio de contraste de fase invertido (Olympus, Tokio, Japón) con un aumento de 10× o 20×. Se capturaron imágenes de cinco campos seleccionados aleatoriamente por pocillo. El recuento de células se realizó manualmente utilizando ImageJ o un software de recuento de células automatizado, según esté disponible. Todos los experimentos se realizaron por triplicado para garantizar la coherencia y la solidez estadística. Los datos se expresan como el número medio de células migradas por campo o como un porcentaje en relación con los controles no tratados.

Ensayo de curación de arañazos

Realizamos ensayos de arañazos (curación de heridas) para estudiar los efectos de la expresión de NSUN2 y el tratamiento con nanopartículas sobre la migración de las células de cáncer colorrectal CT-26. Se utilizaron células CT-26 de tipo salvaje y células diseñadas para sobreexpresar NSUN2 en este estudio. Sembró 5 × 105 células por pocillo en placas de 6 pocillos en un medio completo de RPMI-1640 con un 10 % de FBS. Las células se incubaron durante la noche a 37 °C en una incubadora humidificada con un 5 % de CO2. Una vez que las células alcanzaron una confluencia del 90-100 %, se creó un arañazo uniforme en el centro de cada pocillo utilizando una punta de pipeta estéril de 200 μl. Los pocillos se lavaron dos veces con PBS para eliminar las células desprendidas y los restos. A continuación, añadimos las formulaciones de nanopartículas PRR y PR al medio a una concentración final de ARN de 10 μl/ml. En otro experimento, evaluamos los efectos terapéuticos de las células CT-26 que sobreexpresan NSUN2. Los grupos de control incluyeron células de tipo salvaje no tratadas y células que sobreexpresan NSUN2 tratadas solo con PBS. Todos los experimentos se realizaron por triplicado para garantizar la reproducibilidad. Las células tratadas se mantuvieron en condiciones estándar y se observó su capacidad para migrar hacia el área arañada. Se capturaron imágenes a las 0 h (inmediatamente después del arañazo), 12 h, 24 h, 48 h y 72 h utilizando un microscopio de contraste de fase invertido (Olympus, Japón). Se capturaron imágenes de múltiples campos en cada pocillo para garantizar la coherencia de los resultados. Medimos el ancho del arañazo en cada punto temporal utilizando el software ImageJ.

La tasa de curación se calculó utilizando la siguiente fórmula:

Cierre de la brecha (%) = [(Ancho a las 0 h - Ancho a las X h) / Ancho a las 0 h] × 100.

Evaluación in vivo de la biodistribución y la administración de fármacos

La biodistribución in vivo y la eficacia de la administración tumoral de las formulaciones de nanopartículas se evaluaron utilizando la imagen de todo el cuerpo en vivo y la imagen ex vivo de fluorescencia con nanopartículas cargadas de ARN marcadas con Cy5. Para establecer un modelo de metástasis pulmonar, se inyectaron por vía intravenosa en la vena de la cola ratones hembra BALB/c (de 6 a 8 semanas de edad) con 1,5 × 106 células CT-26-luc por ratón. Después de permitir que los tumores se desarrollaran durante 10 días, los ratones se dividieron aleatoriamente en dos grupos (n = 3 por grupo) para los análisis comparativos. Las dos formulaciones utilizadas fueron PLA-KA26-RNA@Cy5 (PR@cy5), nanopartículas no dirigidas, y PLA-RGD-KA26-RNA@Cy5 (PRR@cy5), nanopartículas dirigidas a RGD para la focalización activa del tumor. Cada ratón recibió una inyección intravenosa (vena de la cola) de 100 μl de cualquiera de las formulaciones que contenían una dosis equivalente de 2 μg/g de siRNA marcado con Cy5. Se realizó una imagen de fluorescencia de todo el cuerpo utilizando un sistema de imagen in vivo (sistema de imagen Xenogen IVIS 200) en varios puntos temporales posteriores a la inyección: 0 h, 4 h, 12 h, 24 h y 48 h. Los ratones se anestesiaron con isoflurano y se colocaron en una cámara de imagen para la imagen. La fluorescencia de Cy5 se detectó utilizando los filtros de excitación (640 nm) y emisión (680 nm) adecuados. Se definieron regiones de interés (ROI) sobre el área torácica (pulmones) y se cuantificaron las intensidades de fluorescencia utilizando el software del instrumento. Las señales de la ROI se expresaron como fotones por segundo por centímetro cuadrado por estereorradián (ph/s/cm2/sr). A las 48 h, se recolectaron los órganos principales, incluidos el corazón, el hígado, el bazo, los pulmones, los riñones y los tejidos tumorales, para la imagen de fluorescencia ex vivo. Se definieron regiones de interés (ROI) y se cuantificó la intensidad de fluorescencia utilizando el software V3Vision. Esto permitió la evaluación de los perfiles de biodistribución de ambas formulaciones dirigidas y no dirigidas. La intensidad de fluorescencia de cada órgano se cuantificó utilizando el mismo método de análisis de la ROI. Los datos se presentan como la señal de fluorescencia media ± DE.

Biocompatibilidad in vivo

Para evaluar la toxicidad sistémica aguda y tardía, se inyectaron por vía intravenosa ratones hembra BALB/c inmunocompetentes con PBS, RR, PRR o PRRP cada tres días a una dosis de 2 μg/g de peso corporal de siRNA durante seis inyecciones. El día 14, después de la administración final de las formulaciones, se sacrificaron los ratones y se recolectaron muestras de sangre para los análisis hematológicos y bioquímicos. Se recolectaron órganos para el examen histopatológico. Las muestras de sangre se recolectaron en tubos Microvette 100 K3E de potasio-EDTA (Sarstedt) para el recuento sanguíneo completo (CBC) y se analizaron por Hangzhou Haoke Biotechnology Co., Ltd. Se recolectó sangre en tubos sin anticoagulantes para los análisis de química sérica. Los parámetros bioquímicos se cuantificaron utilizando kits de reactivos Fuji DRI-CHEM SLIDE combinados con un analizador de química seca Fuji NX500i.

Animales y tumores sinérgicos

Para el establecimiento de un modelo murino de metástasis pulmonar, se seleccionaron ratones hembra BALB/c de 6 a 8 semanas de edad (con un peso de 18 a 22 g) para los fines de la investigación. Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las directrices institucionales para el cuidado de los animales y fueron aprobados por el Comité correspondiente de Cuidado y Uso de Animales. La línea celular murina de cáncer de colon CT-26-luc se cultivó en un medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 enriquecido con un 10% de suero bovino fetal (FBS), un 1% de penicilina-estreptomicina y 150 μg/mL de G418 para mantener la actividad de la luciferasa. Las células se cultivaron en condiciones estándar (37 °C, 5% de CO2) y se recolectaron durante la fase de crecimiento exponencial para evaluar la viabilidad. Para establecer el modelo, a cada ratón se le inyectó por vía intravenosa 1,5 × 106 células CT-26-luc suspendidas en 100 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) estéril a través de la vena de la cola. Este método mejora la circulación sistémica y permite una colonización precisa del tejido pulmonar, imitando eficazmente la diseminación metastásica. Se realizó una imagen de bioluminiscencia (BLI) utilizando un sistema de imagen Xenogen IVIS 200 (PerkinElmer, EE. UU.) para observar la formación de tumores y evaluar la progresión metastásica. Los ratones se escanearon en varios intervalos de tiempo (días 0, 10, 20 y 28) después de la inyección de células tumorales. Se administró D-luciferina por vía intraperitoneal a una dosis de 150 mg/kg, disuelta en PBS estéril, antes de la imagen. Después de un período de incubación de 10 minutos para facilitar la distribución sistémica del sustrato, los ratones fueron sedados con un 2% de isoflurano y colocados en la sala de imagen. La luminiscencia se registró con una duración de exposición de 1 a 5 minutos, utilizando configuraciones adecuadas para el campo de visión, la apertura y el agrupamiento. Las regiones de interés (ROI) se delimitaron manualmente alrededor del área torácica para evaluar las señales tumorales específicas de los pulmones. La intensidad de la señal se midió en fotones por segundo por centímetro cuadrado por estereorradián (ph/s/cm2/sr) utilizando el software V3Vision. Se incluyeron un mínimo de tres ratones en cada grupo de tratamiento (n = 3), y la progresión tumoral se evaluó longitudinalmente a lo largo del estudio. Los resultados de la imagen se utilizaron para evaluar la extensión de la metástasis y la eficacia del tratamiento posterior a las composiciones de nanopartículas específicas del tumor.

Inmunofluorescencia tisular

Los especímenes de tejido recién extraídos se conservaron en un 4% de paraformaldehído a 4 °C durante 2 horas para mantener la arquitectura celular. Después de la fijación, los tejidos se lavaron meticulosamente con PBS y se crioprotegieron durante la noche a 4 °C en una solución de sacarosa al 30% formulada con PBS para evitar la formación de cristales de hielo durante la congelación. Al día siguiente, los tejidos se incluyeron en un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) y se almacenaron a -80 °C hasta el corte. Se prepararon cortes criostáticos con un grosor de 8 μm utilizando un criostato mantenido entre -20 °C y -25 °C. Después del corte, las secciones de tejido se secaron al aire y luego se fijaron en acetona fría (preenfriada a -20 °C) durante 10 minutos para mejorar la preservación del antígeno. Después de la fijación, las láminas se enjuagaron con PBS para eliminar el exceso de acetona. Para la tinción de inmunofluorescencia, las secciones se lavaron brevemente con un 5% de BSA en TBST (TBS + 0,1% de Tween-20), seguido de un bloqueo con este tampón durante 1 hora a temperatura ambiente para reducir la unión inespecífica. Las proteínas unidas se lavaron cuatro veces con 1% de BSA/TBST durante 5 minutos y se enjuagaron dos veces con PBS para eliminar el detergente residual. Las secciones se incubaron con anticuerpos primarios en 1% de BSA/TBST (100 μL por muestra) durante la noche a 4 °C en una cámara humidificada. Al día siguiente, el exceso de anticuerpo se eliminó lavando con cuatro lavados suaves de 1% de BSA/TBST, seguidos de dos enjuagues con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Después de lavar la placa tres veces con 30 μL de WSB por pocillo, se agregaron anticuerpos secundarios directamente en la oscuridad y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Para visualizar los núcleos, se realizó una tinción con DAPI utilizando el colorante (diluido en 1% de BSA/TBST) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de los lavados finales (al menos cuatro ciclos con 1% de BSA/TBST y PBS), las secciones de tejido se secaron al aire en la oscuridad. Se agregó una gota (20 μL) de un medio de montaje antifade a cada lámina y se colocaron suavemente los cubreobjetos y se sellaron con esmalte de uñas transparente para preservar las señales de fluorescencia. Para detectar las células apoptóticas, se realizó un ensayo TUNEL utilizando un kit comercialmente disponible (KeyGEN Biotech, Nanjing, China) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para este ensayo, las secciones se desparafinizaron. Todos los tejidos teñidos se visualizaron bajo un microscopio de fluorescencia Zeiss, y se realizó un análisis cuantitativo, que incluyó el recuento de células teñidas positivamente y las mediciones de la intensidad media de fluorescencia, utilizando el software ImageJ.

Tinción con hematoxilina y eosina (H&E)

La tinción con H&E se realizó en secciones de tejidos FFPE de 3 μm de espesor. Las láminas se incubaron durante la noche a 58 °C para la desparafinización y para garantizar la adhesión y fusión tradicionales de la parafina. Las láminas se desparafinizaron con xileno y se rehidrataron con lavados secuenciales de etanol de 5 minutos (100% seguido de 70%). Las láminas se enjuagaron con agua destilada al día siguiente. Los tejidos recuperados se cortaron en secciones transversales y se tiñeron con hematoxilina y eosina según el procedimiento estándar. Las láminas teñidas se visualizaron utilizando un microscopio de escaneo de láminas OLYMPUS VS200 a alto aumento para extraer datos histológicos detallados.

Análisis estadístico

Se utilizó GraphPad Prism versión 8.0 para el análisis estadístico utilizando una prueba de Student de dos colas. Se utilizó un nivel de significación de p < 0,05 para todos los experimentos. En las figuras, las diferencias estadísticamente significativas se denotan de la siguiente manera: p < 0,05 (*), p < 0,01 () y p < 0,001 (*).

Resultados

Síntesis y caracterización de nanopartículas de PLA

Para los sistemas de administración terapéutica de siRNA in vitro e in vivo, desarrollamos nanopartículas novedosas basadas en formulaciones de PLA y péptidos de penetración celular (CPP) utilizando nanopartículas de PLA (PLA-NP) y PLA-RGD-NP. Se ha demostrado que estas plataformas poliméricas son eficaces para la administración de vacunas [^[22]]. Los núcleos de PLA están rodeados por moléculas hidrófobas; sin embargo, los siRNA no se incorporan fácilmente en las micelas porque son hidrofílicos. Para superar estos desafíos, modificamos nuestro enfoque, pasando de la encapsulación de ARN a la unión de los siRNA a la superficie de las nanopartículas de PLA. Dado que tanto las nanopartículas como los siRNA tienen carga negativa, su unión y estabilidad no son significativas debido a las cargas superficiales; por lo tanto, utilizamos péptidos catiónicos como intermediarios para ayudar a que se unan y cambiar la carga superficial. En particular, probamos WA30 y KA26, dos péptidos de penetración celular (CPP) cargados positivamente conocidos por sus capacidades de condensación de ácidos nucleicos (Fig. 2a-c). Se espera que estos péptidos formen estructuras anfipáticas helicoidales, que son beneficiosas para la entrada celular y la interrupción de la membrana. Primero, preparamos poliplexos de péptido/siRNA (Fig. 2b) y los unimos a las superficies de las nanopartículas de PLA y PLA-RGD (Fig. 2a) para formar nanocomplejos estables (Materiales y Métodos) (Fig. 2c). Las imágenes de TEM de PLA, PLA-RGD y PLA-RGD-KA26-ARN se muestran en la Fig. 2d-f, y los resultados demuestran que las nanopartículas se prepararon con éxito. El tamaño de partícula y la morfología sugieren una acumulación favorable en los sitios tumorales. Se utilizó la dispersión de luz dinámica (DLS) para determinar las propiedades de la formulación (Fig. 2g) de las nanopartículas preparadas. Las nanopartículas de PLA no modificadas tenían aproximadamente 179 nm de diámetro y un potencial zeta de -22 mV (Fig. 2h). Cuando se adsorbió el poliplexo, la carga superficial de las nanopartículas cambió a aproximadamente +25 mV (Fig. 2h), y el tamaño de partícula aumentó, lo que indica que los complejos de péptido/siRNA recubrieron eficazmente las nanopartículas. PLA formó los nanocomplejos más grandes (aproximadamente 179 nm), mientras que PLA-KA26-ARN, PLA-RGD y PLA-RGD-KA26-ARN (PRR) formaron nanocomplejos más grandes (aproximadamente 202, 209 y 225 nm, respectivamente). Todas las formulaciones tenían bajos índices de polidispersidad (PDI ≈ 0,1), lo que indica que las partículas tenían aproximadamente el mismo tamaño (Fig. 2g). Se probaron las formulaciones para la estabilidad durante al menos 7 días a 4 °C (Fig. 2i). Como se muestra en la Fig. 2i, el tamaño se mantuvo igual en diferentes disolventes. Nuestros hallazgos validan que se pueden preparar siRNA estables y nanocomplejos de siRNA utilizando nanopartículas basadas en PLA y CPP. Los péptidos de penetración celular mantuvieron su capacidad para condensar los ácidos nucleicos incluso después de unirse a las nanopartículas, lo que indica su potencial para su uso en sistemas de administración de ARN.

Captación celular y eficiencia de administración in vivo de las formulaciones de PLA-ARN

Para la captación y la internalización celular, utilizamos microscopía confocal láser de barrido (CLSM) y citometría de flujo para determinar el grado en que los nanocomplejos de PLA-WA30-ARN y PLA-KA26-ARN@Cy5 entraron en las líneas celulares tumorales RKO y MC38 y administraron ARN a las células. Se utilizó ARN etiquetado con Cy5 en un modelo de seguimiento de fluorescencia de la vía de captación de ARN terapéutico [^[23]]. Después de 4 horas de incubación, la intensidad de fluorescencia roja intracelular aumentó notablemente, particularmente en el grupo de tratamiento con PLA-KA26-ARN@Cy5 (Fig. 3a-b), lo que indica una rápida y eficiente internalización celular de la formulación. Como se muestra en la Fig. 3a-b, el grupo PLA-KA26-ARN@Cy5 exhibió la intensidad de fluorescencia más alta en comparación con el grupo de ARN desnudo. PLA-KA26-ARN@Cy5 exhibió la fluorescencia intracelular más fuerte en las líneas celulares MC38 y RKO. Estos resultados también sugieren que PLA-KA26-ARN@Cy5 tiene mejores efectos de internalización y administración que PLA-WA30-ARN@Cy5. En contraste, el grupo de Cy5@ARN desnudo mostró casi ninguna fluorescencia roja en ninguna de las líneas celulares en ningún momento, porque el ARN no formulado tiene carga negativa y es hidrofílico, lo que dificulta su absorción por las células (Fig. 3a-b).

Para evaluar aún más la eficiencia de administración intracelular de las diferentes formulaciones de siRNA, se realizó un análisis de citometría de flujo utilizando nanopartículas de PLA cargadas con siRNA etiquetadas con Cy5 en células MC38. Preparamos NP con péptido RGD, PLA-KA26-ARN@Cy5, PLA-RGD-KA26-ARN@Cy5, PLA-WA30-ARN@Cy5 y PLA-RGD-WA30-ARN@Cy5, y evaluamos su rendimiento de captación celular. Como se muestra en las superposiciones del histograma (Fig. 3c-g), todas las formulaciones de nanopartículas exhibieron una captación celular considerable en comparación con el control (ARN desnudo). Entre las formulaciones experimentales, PLA-RGD-KA26-ARN@Cy5 demostró la mayor captación celular (69,87%), que fue significativamente mayor que la de las otras formulaciones (p < 0,01 en comparación con PLA-WA30-ARN y PLA-KA26-ARN). PLA-KA26-ARN@Cy5 también logró una captación sustancial, alcanzando el 58,33%, mientras que PLA-RGD-WA30-ARN@Cy5 y PLA-WA30-ARN@Cy5 demostraron eficiencias de captación del 59,69% y el 35,41%, respectivamente (Fig. 3c-g). El análisis cuantitativo de la intensidad media de fluorescencia (MFI), resumido en el gráfico de barras (Fig. 3h), confirmó aún más que la incorporación del péptido RGD mejoró notablemente la internalización celular, especialmente en la formulación de PLA-RGD-KA26-ARN. La modificación dirigida utilizando RGD, que mejora la endocitosis mediada por receptores a través de la unión a la integrina, probablemente contribuyó a un mejor rendimiento [^[24],^[25]]. Estos resultados demuestran que todas las formulaciones de nanopartículas de siRNA basadas en PLA administran ARN de manera eficiente a las células. Sin embargo, PLA-RGD-KA26-ARN@Cy5 superó a todas las demás formulaciones probadas en términos de captación celular y es un vehículo de administración altamente prometedor para terapias basadas en siRNA dirigidas a células tumorales que expresan en exceso integrinas. PLA-RGD-KA26-ARN se seleccionó para análisis adicionales.

Para evaluar la biodistribución in vivo y la eficiencia de direccionamiento tumoral de las nanopartículas PLA-RGD-KA26-RNA, se establecieron modelos murinos de metástasis pulmonar CT-26-luciferasa (CT-26-luc) (Fig. 3i). Se compararon dos formulaciones: PLA-KA26-RNA@Cy5 (no dirigida) y PLA-RGD-KA26-RNA@Cy5 (dirigida con el péptido RGD). El etiquetado fluorescente con Cy5 permitió el seguimiento en tiempo real de la distribución de las nanopartículas después de la inyección intravenosa mediante imágenes in vivo en múltiples puntos temporales (0, 4, 12, 24 y 48 h). Como se muestra en la Fig. 3j, la señal de fluorescencia en los ratones tratados con PLA-RGD-KA26-RNA@Cy5 fue significativamente mayor en la región pulmonar, especialmente a las 4 y 12 h después de la inyección, lo que indica la acumulación eficiente de la formulación dirigida en el sitio de las metástasis pulmonares. En contraste, el grupo PLA-KA26-RNA@Cy5 (no dirigida) mostró una señal de fluorescencia mucho más débil y más dispersa, lo que sugiere un direccionamiento tumoral limitado y una biodistribución no específica. A las 24 h, la señal en el grupo PLA-RGD permaneció concentrada en la región torácica, mientras que se redujo considerablemente en el grupo no dirigido. A las 48 h, solo quedaban señales mínimas en ambos grupos, lo que indica la eliminación de las nanopartículas de la circulación.

La Fig. 3k muestra imágenes fluorescentes de los principales órganos (pulmón, hígado, bazo, corazón y riñón) obtenidas 48 h después de la inyección. El grupo que recibió PLA-RGD-KA26-RNA@Cy5 exhibió una fluorescencia mucho mayor en los tejidos pulmonares, lo que sugiere que el fármaco se acumuló más en los sitios de metástasis pulmonares. En contraste, el grupo PLA-KA26-RNA@Cy5 mostró una fluorescencia débil en todos los órganos, y solo se observó una pequeña cantidad de localización específica en el pulmón. Esta diferencia indica que el direccionamiento activo mediado por RGD es eficaz contra los tumores metastásicos en los pulmones. El análisis cuantitativo de la región de interés (ROI) a partir de las imágenes in vivo (Fig. 3l) validó aún más estos resultados. El grupo PLA-RGD-KA26-RNA@Cy5 exhibió valores de ROI significativamente más altos a las 4 y 12 h que el grupo no dirigido, lo que confirma una mayor acumulación tumoral. Después de 24 h, se observó fluorescencia en ambos grupos; sin embargo, el grupo dirigido exhibió una señal más fuerte en los pulmones. La Fig. 3m muestra la biodistribución de las señales fluorescentes en los órganos recolectados. La escala logarítmica reveló que PLA-RGD-KA26-RNA@Cy5 se acumuló en los pulmones en aproximadamente una magnitud mayor que en los otros órganos principales. En contraste, el grupo PLA-KA26-RNA@Cy5 exhibió una señal más uniformemente distribuida, lo que indica una captación no específica y un direccionamiento tumoral limitado. Estos resultados demuestran que el sistema de nanopartículas PLA-RGD-KA26-RNA funcionalizado con RGD mejora significativamente la administración a los tumores pulmonares metastásicos in vivo mediante un direccionamiento activo. Estos hallazgos validan la superioridad de la formulación dirigida sobre el sistema no dirigido para la administración específica de ARN a los tumores y respaldan su potencial para la aplicación terapéutica en el cáncer colorrectal metastásico.

Eficiencia de silenciamiento de NSUN2-siRNA y regulación descendente dependiente de la dosis mediante nanocomplejos PRR

Para evaluar la eficacia de NSUN2 en el silenciamiento y la regulación descendente del microambiente tumoral (Fig. 4a). Se desarrollaron tres candidatos de siRNA distintos (siRNA1, siRNA2 y siRNA3) dirigidos a NSUN2 para determinar la secuencia más eficaz para el silenciamiento génico (Fig. 4b) (Tabla 2). Los siRNA se transfectaron en células CT-26 (Fig. 4c). Se utilizó Western blot (Fig. 4c) para evaluar la eficacia del silenciamiento a nivel de proteína. Todos los siRNA mostraron excelentes efectos de silenciamiento, siendo el siRNA1 el que demostró el efecto de silenciamiento más significativo, disminuyendo marcadamente los niveles de proteína NSUN2 en relación con los de los controles normales (NC) y las células tratadas con otros siRNA. La imagen cualitativa del blot indicó una reducción significativa en la intensidad de la banda NSUN2 para el siRNA1 en comparación con la de siRNA2 y siRNA3. Esto indica que el siRNA1 fue más eficaz para inhibir la síntesis de proteínas. El análisis densitométrico cuantitativo normalizado a tubulina (control de carga) corroboró estos resultados (Fig. 4d). El grupo siRNA1 tuvo una proporción NSUN2/tubulina mucho menor, con aproximadamente un 87% de silenciamiento, en comparación con el grupo de control (p < 0,01). En contraste, el siRNA2 resultó en una disminución moderada (aproximadamente un 40% de silenciamiento), lo que fue estadísticamente significativo en comparación con el NC (p < 0,05). El siRNA3 exhibió una reducción mínima y no fue estadísticamente diferente del control (ns, p > 0,05). Estos resultados confirmaron que el siRNA1 es la secuencia más eficaz para el silenciamiento de NSUN2 en las células CT-26. Las secuencias específicas de los tres siRNA se muestran en la Fig. 4b. Basándose en los datos cualitativos y cuantitativos, se seleccionó siNSUN2-1 para una posterior formulación terapéutica en el sistema de administración PLA-RGD-KA26-RNA (PRR).

Para confirmar aún más la eficacia del silenciamiento génico de los nanocomplejos PRR (cargados con siRNA1), realizamos una PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) para examinar la expresión de ARNm de NSUN2 en las líneas celulares de cáncer colorrectal CT-26 y HCT-116. Las células se trataron con la formulación de nanocomplejos (denominada PRR) durante 36 h, después de lo cual se extrajo el ARN total y se cuantificaron los niveles de ARNm utilizando β-actina como gen de referencia interno. Se observó una marcada supresión de la expresión de NSUN2 mediante qPCR en ambos tipos de células después del tratamiento con PRR (Fig. 4e-f). Esto subraya la eficacia de la administración de siRNA y el silenciamiento génico. La expresión de NSUN2 se redujo significativamente después del tratamiento con PRR, con niveles relativos de ARNm que disminuyeron de 1,00 ± 0,25 veces en el grupo de control a aproximadamente 0,38 ± 0,20 veces después del tratamiento, lo que corresponde a una reducción de aproximadamente el 60% en la expresión (p < 0,05, n = 3) (Fig. 4e). De manera similar, en las células HCT-116 (Fig. 4f), el tratamiento con PRR condujo a una supresión pronunciada de la expresión de NSUN2. Los niveles relativos de ARNm se redujeron de 1,00 ± 0,03 veces en las células de control a aproximadamente 0,45 ± 0,06 veces en el grupo tratado, lo que representa una disminución de aproximadamente el 55% en los niveles de transcripción (p < 0,001, n = 3).

Para validar la eficacia del silenciamiento génico de los nanocomplejos PRR, las células cancerosas CT-26 y HCT-116 se trataron con concentraciones crecientes de ARN en los nanocomplejos (0,625, 1,25, 2,5, 5 y 10 μL). El análisis de Western blot (Fig. 4g-h) reveló una reducción dependiente de la concentración en los niveles de proteína NSUN2 en ambas líneas celulares. La tubulina se utilizó como control de carga y referencia de normalización. En las células CT-26 (Fig. 4g), se observó una marcada disminución en la expresión de NSUN2 a partir de 1,25 μL, con una regulación descendente significativa evidente a 2,5 μL y un silenciamiento casi completo a 5 y 10 μL. El análisis de Western blot (Fig. 4h) cuantificó esta tendencia, lo que indica que la relación NSUN2/tubulina disminuyó a aproximadamente el 48% a 2,5 μL y aproximadamente el 17,2% y el 13% a 5 y 10 μL, respectivamente, en comparación con los controles no tratados (establecidos en 100%). La regulación descendente fue estadísticamente significativa (p < 0,01 a 5 μL y p < 0,001 a 10 μL), lo que indica un potente efecto dependiente de la dosis. La visualización del mapa de calor (Fig. 4i) corroboró estos hallazgos, lo que demostró una mayor supresión a dosis más elevadas, particularmente a volúmenes de 5 y 10 μL.

De manera similar, en las células HCT-116 (Fig. 4j), se observó una disminución dependiente de la dosis en la expresión de NSUN2. Los resultados de nuestro experimento indicaron un silenciamiento significativo a 1,25 μL y una supresión pronunciada a 5 y 10 μL. El análisis cuantitativo (Fig. 4k) mostró que los niveles de NSUN2 fueron aproximadamente el 47,75% y el 34% de los niveles de control a 5 y 10 μL, respectivamente. Esta disminución fue estadísticamente significativa (p < 0,01) solo en la dosis más alta. El mapa de calor en la Fig. 4l muestra una tendencia de supresión similar a la observada en las células CT-26, lo que confirma que el impacto del silenciamiento también se puede observar en otras líneas celulares. Estos resultados son coherentes con los datos de selección de secuencias de siRNA anteriores, que indicaron que el siRNA1 demostró la mayor eficacia de silenciamiento (Fig. 4). Estos hallazgos respaldan firmemente la hipótesis de que los nanocomplejos PRR facilitan eficazmente la administración de siRNA a las células, lo que conduce a un silenciamiento eficiente y dependiente de la dosis de NSUN2. Estos resultados destacan las ventajas de PRR como un nanocargador viable para el tratamiento basado en la interferencia de ARN (RNAi), particularmente en las malignidades en las que NSUN2 desempeña un papel fundamental.

Las nanopartículas dirigidas inhiben la migración de las células cancerosas

Para evaluar aún más el potencial antimigratorio de los nanocomplejos PRR, se realizaron ensayos de migración Transwell utilizando dos líneas celulares de cáncer colorrectal: HCT-116 y CT-26. Las células se trataron con PBS (control), PR (no dirigido) o PRR (dirigido). Las células se tiñeron con cristal violeta y se calculó el número de células migrantes. Se observó un gran número de células migrantes tanto en los grupos tratados con PR como en el grupo de control (Fig. 5a). Se observó un gran número de células teñidas de cristal violeta en la membrana de Transwell mediante microscopía. Esto indicó el fuerte comportamiento migratorio de los grupos de células no tratadas y tratadas con PR. En contraste, el grupo tratado con PRR mostró menos células migrantes, con solo unas pocas células débilmente teñidas observadas (Fig. 5a). Estos resultados indicaron una inhibición significativa de la migración celular. El examen visual de estas imágenes confirmó el nivel cuantitativo, donde el grupo tratado con PRR mostró una disminución de aproximadamente 4,2 veces en el número de células migrantes en comparación con el control (p < 0,0001) y una disminución de 2,3 veces en comparación con el grupo PR (p < 0,01) (Fig. 5b). Estos resultados respaldan firmemente la conclusión de que la administración dirigida por RGD a través del nanocomplejo PRR previene eficazmente la migración de las células de carcinoma colorrectal HCT-116. De manera similar a la línea celular HCT-116, se observó una tendencia comparable en la línea celular CT-26. Tanto el grupo de control como el grupo PR mostraron altos niveles de migración en el presente estudio. Sin embargo, las células tratadas con el nanocomplejo PRR mostraron una migración marcadamente reducida, con menos células y un tinte más claro en toda la superficie de la membrana (Fig. 5b). El examen visual de estas imágenes se confirmó a nivel cuantitativo, donde el grupo tratado con PRR mostró una reducción de aproximadamente 3,5 veces en el número de células migrantes en comparación con el grupo de control (p < 0,001) y una disminución de aproximadamente 1,8 veces en relación con el grupo PR (p < 0,01) (Fig. 5d). Cabe destacar que no hubo una diferencia significativa entre los grupos de control y PR (ns, p > 0,05), lo que destaca la importancia de la funcionalización con RGD para lograr efectos terapéuticos.

Para corroborar el efecto antimigratorio observado en el experimento de migración Transwell, se realizó un ensayo de curación de heridas por arañazos utilizando células CT-26. Después de crear un arañazo suave en monocapas de células, las células se trataron con PBS (control), PR no dirigido o nanocomplejos PRR dirigidos. Se capturaron imágenes del cierre de la herida a las 0, 24, 48 y 72 h después del tratamiento (Fig. 5e). Las células tratadas con PBS y PR mostraron una reparación gradual de la herida con el tiempo, con un cierre significativo observado en el grupo de control a las 72 h después de la aplicación de la herida. En contraste, las células tratadas con PRR mostraron un retraso marcado en la curación de la herida, con el área del arañazo permaneciendo en gran parte abierta durante 72 h. Un estudio cuantitativo del cierre de la herida (Fig. 5g) demostró una disminución estadísticamente significativa en la capacidad migratoria del grupo tratado con PRR en todos los puntos temporales posteriores al tratamiento. Después de 24 h, el porcentaje de cierre de la herida fue de solo el 5% en el grupo PRR, mientras que fue del 22% en el grupo PR y del 21% en el grupo PBS (p < 0,0001). Después de 48 h, las células tratadas con PRR curaron solo el 15% de sus heridas, mientras que las tratadas con PR y control curaron el 34% y el 46%, respectivamente (p < 0,0001 PRR frente a control, p < 0,05 PRR frente a PR). A las 72 h, PRR exhibió una tasa de cierre sustancialmente deteriorada del 15%, en contraste con el 44% en el grupo PR y el 53% en el grupo de control (p < 0,0001 para ambas comparaciones).

Para evaluar si la sobreexpresión de NSUN2 influye en los efectos antimigratorios de los nanocomplejos de siRNA basados en PLA, se realizó un ensayo de curación de heridas mediante el rascado de células transfectadas con un plásmido de sobreexpresión de NSUN2. Los grupos experimentales incluyeron aquellos tratados con PR, PRR y un grupo tratado con PBS como control positivo (Fig. 5f). A las 24 horas después del rascado, el cierre de la herida en el grupo de control progresó hasta aproximadamente el 32%, mientras que las células tratadas con PR y PRR mostraron tasas de cierre significativamente reducidas, de aproximadamente el 18% y el 10%, respectivamente. Después de 48 horas de tratamiento, la brecha en el grupo de control fue de aproximadamente el 53%, mientras que la brecha en las células tratadas con PR y PRR fue de aproximadamente el 44% y el 29%, respectivamente. El grupo de control mostró un 75% de cierre de la herida después de 72 horas, mientras que las células tratadas con PR cerraron el 50% de la herida, y el grupo tratado con PRR permaneció mayormente cerrado en un 32%. El análisis estadístico demostró que el tratamiento con PRR inhibió significativamente la curación de la herida en todos los puntos temporales en comparación con el grupo de control (p < 0,0001). PRR suprimió constantemente la migración celular a las 24 horas (p < 0,01), 48 horas (p < 0,01) y 72 horas (p < 0,0001), lo que destaca la eficacia antimigratoria superior de los nanocomplejos funcionalizados con RGD (Fig. 5h). Para evaluar el potencial antimigratorio de las nanopartículas de PRR, se realizó un ensayo de curación de heridas (rascado) utilizando una variedad de concentraciones de nanopartículas (0,625, 1,25, 2,5, 5 y 10 μL). Se capturaron imágenes microscópicas a las 0, 24, 48 y 72 horas después del tratamiento para controlar el cierre del área de raspado a lo largo del tiempo (Fig. 5j). En el grupo de control no tratado, las células exhibieron una migración rápida, con un cierre casi completo de la herida observado a las 72 horas. En contraste, los grupos tratados con PRR demostraron una inhibición dependiente de la concentración de la migración celular. A concentraciones más bajas (0,625 μL y 1,25 μL), se observó un cierre parcial de la herida a las 72 horas, lo que indica una supresión leve de la actividad migratoria. Sin embargo, a concentraciones más altas (2,5 μL a 10 μL), el cierre de la herida siguió siendo significativamente deficiente incluso después de 72 horas, y el área de raspado era claramente visible en comparación con el grupo de control. Estos resultados indicaron que las nanopartículas de PRR inhibieron eficazmente la migración de las células cancerosas de manera dependiente de la dosis (Fig. 5k). La marcada reducción en la curación de la herida a concentraciones más altas de nanopartículas sugiere un fuerte efecto antimigratorio, posiblemente relacionado con el silenciamiento dirigido de NSUN2 y la interrupción de las vías de motilidad celular (Fig. 5i).

Diseño del modelo terapéutico in vivo para metástasis pulmonar

Para investigar el potencial terapéutico de las formulaciones de nanopartículas cargadas con ARN en el cáncer colorrectal metastásico, se utilizó un modelo de ratón BALB/c inmunocompetente de metástasis pulmonar. Las células CT-26 que expresan de forma estable la luciferasa (CT-26/Luc) se administraron mediante inyección en la vena de la cola a una dosis de 1 × 105 células por ratón el día 0 para iniciar la colonización pulmonar. El día 10, cuando se habían formado nódulos metastásicos, los ratones se asignaron aleatoriamente a los grupos de tratamiento (n = 3 por grupo) y recibieron inyecciones intravenosas de las siguientes formulaciones: PR, PRR, anticuerpo anti-PD-L1 (PD-L1), un tratamiento combinado (PRRP: PRR + anticuerpo anti-PD-L1) o PBS como control no tratado (Fig. 6a). Cada tratamiento se administró a una dosis equivalente a 2 μg de ARN por gramo de peso corporal y se administró por vía intravenosa los días 11, 14, 17, 20 y 24 después de las lesiones. La progresión tumoral se controló de forma no invasiva mediante imágenes bioluminiscentes con el sistema Xenogen IVIS Spectrum después de la inyección intraperitoneal de D-luciferina. El día 28, se sacrificaron los ratones y se recolectaron los tejidos pulmonares para la obtención de imágenes al final del estudio y la cuantificación de la carga tumoral.

La eficacia terapéutica de los nanocomplejos de PRR se evaluó en un modelo de metástasis pulmonar establecido utilizando ratones BALB/c. Cada ratón recibió una inyección intravenosa de 1,5 × 105 células CT-26 que expresan de forma estable la luciferasa (CT-26-Luc) a través de la vena de la cola para promover la colonización metastásica en los pulmones. Una vez que se generó el tumor, se confirmó mediante imágenes bioluminiscentes in vivo (Fig. 6a). Todos los ratones recibieron al menos cinco dosis en 18 días. Se realizaron imágenes bioluminiscentes (BLI) los días 0, 10 y 18, a partir de la primera dosis, para controlar la progresión tumoral (Fig. 6b). Los ratones de los grupos de control y PR mostraron un crecimiento tumoral rápido y agresivo. En contraste, los grupos de PRR y PRRP mostraron una supresión significativa de las señales tumorales, y la reducción más pronunciada se observó en el grupo de combinación PRRP (Fig. 6c). El análisis cuantitativo de la ROI (región de interés) confirmó que los grupos PRRP y PRR mostraron una reducción significativa en la intensidad de la bioluminiscencia el día 18, que fue significativamente menor que la de los grupos de control y PR (p < 0,001).

Los pulmones se recolectaron al final del estudio (día 28) para la evaluación morfológica general (Fig. 6d) con el fin de investigar más a fondo la eficacia antimetastásica de la terapia combinada. Los pulmones de los ratones del grupo de control y del grupo tratado con PR tenían una alta carga de nódulos metastásicos. Sin embargo, los ratones tratados con PRR y PRRP parecían en gran medida normales. Numerosos nódulos pulmonares metastásicos (Fig. 6e) corroboraron este hallazgo. El grupo PRR (media de 65 nódulos) mostró una reducción significativa, y el número fue el más bajo en el grupo PRRP (30 nódulos) en comparación con más de 150 nódulos en el grupo de control (p < 0,001 para PRR y PRRP frente al control) (Fig. 6e). Estos datos demuestran que la administración dirigida de siRNA de NSUN2 a través de los nanocomplejos de PRR inhibe eficazmente la progresión tumoral y la metástasis pulmonar, con una mayor mejora cuando se combina con la terapia de bloqueo del punto de control inmunitario PD-L1.

Después de investigar la carga de cáncer de pulmón metastásico in vivo, se recolectaron los pulmones y se realizaron imágenes bioluminiscentes ex vivo (BLI) al final del estudio (día 28). Los pulmones de los grupos de control y PR exhibieron una intensa bioluminiscencia. Esto indica una alta carga de tumores metastásicos (Fig. 6f). De manera similar, se observó una luminiscencia moderada en el grupo de monoterapia con PD-L1, lo que sugiere una inhibición parcial del crecimiento metastásico. En contraste, los grupos tratados con PRR y PRR + PD-L1 mostraron una luminiscencia significativamente reducida. El grupo PRR + PD-L1 demostró la intensidad de bioluminiscencia más baja entre todos los grupos, lo que indica una supresión casi completa de las señales asociadas con el tumor (Fig. 6f). Estos hallazgos se confirmaron mediante el análisis cuantitativo de la región de interés (ROI) en los tejidos pulmonares (Fig. 6g). Entre las comparaciones de grupos, el grupo PRR mostró una señal luminiscente significativamente reducida en comparación con el grupo de control (p < 0,001). Sin embargo, PRR + PD-L1 condujo a una disminución >80% en el flujo de fotones en comparación con el control (p < 0,0001). Estos resultados demuestran la eficacia terapéutica superior de los nanocomplejos de PRR en la reducción de la carga tumoral metastásica pulmonar, particularmente cuando se combinan con la inhibición del punto de control inmunitario.

Se controlaron los pesos corporales de los ratones durante todo el período del estudio durante las investigaciones terapéuticas in vivo. El propósito de este estudio fue evaluar la tolerabilidad sistémica y el estado general de salud (Fig. 6h). Se observó una disminución gradual del peso corporal en todos los grupos de tratamiento y control. Esto probablemente se deba a la carga tumoral, el estrés metabólico relacionado con la enfermedad y el estrés oxidativo, lo que conduce a una reducción del apetito en los pacientes con cáncer. Este es un fenómeno común en el cáncer [^[26],^[27]]. Inicialmente, los ratones de los grupos PRR y PRRP mostraron pérdida de peso; sin embargo, se observó un aumento gradual del peso corporal a partir del día 18 (Fig. 6h). Esta estabilización y recuperación del peso corporal se correlacionaron con una reducción de la carga tumoral. En contraste, los ratones tratados con PBS (control), PR y anticuerpo de monoterapia con PD-L1 mostraron pérdida de peso durante todo el período del estudio. Estos hallazgos subrayan la eficacia terapéutica de PRR y PRRP y destacan sus perfiles de seguridad favorables, como lo demuestra el mantenimiento o la mejora del peso corporal, un punto final crítico en los estudios preclínicos de oncología [^[28],^[29]]. La terapia con PRR, particularmente en combinación con PD-L1, ofrece las ventajas duales de una potente actividad antitumoral y una toxicidad sistémica mínima.

Análisis inmunohistoquímico de la regresión tumoral y la activación inmune después del tratamiento

Aunque los resultados in vitro e in vivo fueron significativamente positivos, los mecanismos moleculares subyacentes responsables de la eficacia terapéutica observada in vitro e in vivo deben ser dilucidados. Se evaluó la expresión de NSUN2 ex vivo en los tejidos pulmonares recolectados de los ratones. El análisis de PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) reveló una reducción significativa en la expresión de ARNm de NSUN2 en los grupos PRR y PRRP (Fig. 7a). En comparación con el grupo de control, el tratamiento con PRR resultó en un cambio de aproximadamente 0,35 veces en los niveles de transcripción de NSUN2. En contraste, el grupo PRRP mostró una supresión significativa, con un cambio de 0,24 veces. Estos resultados indican un efecto de silenciamiento sinérgico cuando se utilizan PRR en combinación con inhibidores del punto de control. Las mismas muestras se utilizaron para la inmunotransferencia para determinar la expresión de proteínas (Fig. 7b-c). Los grupos tratados con PRR y PRRP mostraron una disminución en la expresión de la proteína NSUN2, y el grupo PRRP mostró la reducción más profunda en los niveles de proteína NSUN2. Por el contrario, PR y PD-L1 tuvieron solo efectos modestos o insignificantes en los niveles de expresión de NSUN2. Estos datos demuestran que las nanopartículas de PRR suprimen eficazmente la metástasis pulmonar in vivo a través de la administración dirigida de siRNA de NSUN2 en combinación con PD-L1. Estos hallazgos respaldan firmemente el uso de PRR como un prometedor agente nanoterapéutico basado en ARN para el tratamiento del cáncer metastásico.

Se realizaron análisis inmunohistoquímicos integrales en los tejidos pulmonares recolectados de todos los grupos de tratamiento. La tinción con hematoxilina y eosina (H&E) reveló diferencias significativas entre los grupos. Los tejidos pulmonares del grupo de control mostraron células tumorales densamente agregadas caracterizadas por una atipia nuclear significativa, una relación núcleo-citoplasma elevada y una arquitectura alveolar gravemente comprometida, lo que indica una proliferación agresiva y metastásica (Fig. 7d). Los tejidos de los grupos de monoterapia con PR y PD-L1 (Fig. 7d) mostraron una ligera disminución de la carga tumoral, acompañada de una restauración parcial de las estructuras alveolares y características de apoptosis dispersas. En el grupo PRR (Fig. 7d), el tumor se redujo notablemente, con áreas claras de necrosis y grupos tumorales más pequeños observados. De manera notable, las secciones pulmonares del grupo de terapia combinada (PRRP) (Fig. 7d) exhibieron una resolución casi completa de las lesiones tumorales, con una morfología de los tejidos que se asemejaba estrechamente a la del parénquima pulmonar sano y una mínima metástasis residual. Estos hallazgos histopatológicos respaldan firmemente la eficacia antitumoral mejorada lograda a través de la estrategia dual de administración dirigida de ARN y bloqueo del punto de control inmunitario, lo que destaca el potencial terapéutico de este enfoque combinatorio para el tratamiento del cáncer colorrectal metastásico.

Reclutamiento de células T

Hemos medido la actividad inmune mediante la tinción para células T CD4+ y CD8+. En el grupo de control, las señales de CD4+ y CD8+ fueron moderadas y bajas, respectivamente, lo que indica una activación inmune débil. Tanto las terapias monoterápicas con PD-L1 como con PR aumentaron ligeramente los niveles de células T, aunque la infiltración siguió siendo modesta. El grupo PRR mostró un aumento significativo de las células T CD8+, lo que indica una respuesta antitumoral más fuerte que la de los otros grupos. Esto probablemente se deba al silenciamiento de NSUN2, lo que mejora la presentación del antígeno. La respuesta más fuerte se observó en el grupo PRRP (Fig. 7e–f). Este grupo exhibió la mayor infiltración tanto de células T CD4+ (Fig. 7g) como de células T CD8+ (Fig. 7h). Con base en estos resultados, el tratamiento activó una robusta respuesta inmune adaptativa y eliminó los tumores mediante la actividad de las células T. Como se muestra en la Fig. 7i, la relación CD4+/CD8+ fue estadísticamente significativa. El aumento del reclutamiento de células T en los pulmones demostró el efecto inmunomodulador de la combinación del nanocomplejo PRR y el bloqueo de PD-L1. Esto ocurre a través de vías tanto intrínsecas al tumor (silenciamiento de NSUN2) como de inhibición externa de los puntos de control inmunitario.

Índice de proliferación Ki67: supresión del crecimiento tumoral

Se utilizó la tinción de Ki67 para evaluar la proliferación de las células tumorales en los diferentes grupos. Se observó una intensa tinción nuclear de Ki67 en los grupos de control y PR, lo que indica una alta proliferación celular. Se observó una modesta reducción de las células Ki67 positivas en el grupo de monoterapia con PD-L1, lo que refleja una supresión inmunoterapéutica parcial. En particular, se observó una disminución marcada de la expresión de Ki67 en el grupo tratado con PRR, lo que sugiere una inhibición significativa de la proliferación tumoral debido al silenciamiento de NSUN2. Este efecto se potenció aún más en el grupo PRRP, donde los núcleos Ki67 positivos eran mínimos o estaban ausentes, lo que implica una detención casi completa del crecimiento tumoral (Fig. 7j). Como se muestra en la Fig. 7l, el grupo de control exhibió señales de proliferación significativamente más altas que los grupos tratados. Estos hallazgos se alinean con la regresión tumoral observada mediante la tinción con H&E y respaldan aún más el potente efecto antiproliferativo de la terapia combinada.

Ensayo TUNEL: inducción de la apoptosis

Se evaluó la muerte celular apoptótica mediante el ensayo TUNEL, en el que la fluorescencia verde indicó la fragmentación del ADN y las células apoptóticas. Los grupos de control y PR mostraron pocas o ninguna célula TUNEL positiva, lo que indica una baja actividad apoptótica basal (Fig. 7k). El grupo de PD-L1 exhibió una apoptosis moderada, lo que fue consistente con su eficacia parcial. En contraste, el grupo PRR mostró un aumento de las células TUNEL positivas, lo que indica una inducción eficaz de la muerte celular programada. El grupo PRRP también demostró un alto nivel de apoptosis; sin embargo, las señales no fueron significativamente altas (Fig. 7m). Esta observación sugiere que la combinación del silenciamiento de NSUN2 y la activación inmune puede promover sinérgicamente la muerte de las células tumorales a través de vías apoptóticas.

En conjunto, estos análisis histológicos e inmunofluorescentes proporcionan evidencia convincente de que PLA-RGD-KA26-RNA (PRR), particularmente cuando se combina con el bloqueo de PD-L1 (PRRP), ejerce efectos antitumorales multimodales sobre las lesiones pulmonares metastásicas. Estos efectos incluyeron la regresión tumoral (H&E), el aumento de la infiltración de células T (CD4+ y CD8+), la supresión de la proliferación (Ki67) y el aumento de la apoptosis (TUNEL). El mayor beneficio terapéutico se observó en el grupo PRRP, lo que enfatiza el potencial de la inmunonanoterapia combinada dirigida a los reguladores epigenéticos, como NSUN2, junto con los puntos de control inmunitarios. Estos hallazgos refuerzan la promesa de esta estrategia para el tratamiento de cánceres metastásicos inmunorresistentes y proporcionan una base sólida para la futura traslación clínica.

Seguridad in vivo

Para evaluar la seguridad sistémica y la posible toxicidad fuera del objetivo de los nanocomplejos PRR y su combinación con el bloqueo del punto de control inmunitario de PD-L1 (PRRP), se realizó una evaluación histológica exhaustiva y se realizó un análisis el día 14 posterior al tratamiento. Los ratones BALB/c (n = 3 por grupo) se dividieron en cinco grupos: PBS (control), PR, PD-L1 (anticuerpo solo), PRR y PRRP, y se les administraron sus respectivos tratamientos por vía intravenosa cada tres días, para un total de seis dosis (Fig. 8j). Al final del estudio, los ratones fueron sacrificados mediante exposición controlada a CO2, y se recolectaron los principales órganos, incluidos los pulmones, el corazón, el hígado, el bazo y los riñones, de todos los grupos experimentales. Se realizaron evaluaciones histopatológicas, hematológicas y bioquímicas séricas exhaustivas. El examen histológico de los principales órganos (pulmón, corazón, hígado, bazo y riñón) no reveló ninguna anomalía relacionada con el tratamiento en ninguno de los grupos. El análisis hematológico mostró que los recuentos de glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas se mantuvieron dentro del rango fisiológico en todos los grupos, sin diferencias estadísticamente significativas en relación con los controles. Los índices de glóbulos rojos (VCM y HCM) no cambiaron, lo que indica una eritropoyesis y morfología de glóbulos rojos preservadas. Los marcadores bioquímicos séricos de la función renal (creatinina y BUN) y la función hepática (AST y ALT) fueron comparables en todos los grupos de tratamiento y controles, sin evidencia de deterioro renal o hepático (Fig. 8a–i). Las secciones pulmonares mostraron una arquitectura alveolar preservada sin inflamación, edema o fibrosis. Los tejidos cardíacos mostraron fibras miocárdicas intactas sin evidencia de degeneración o infiltración inflamatoria en el corazón. Las secciones hepáticas exhibieron una organización lobulillar normal con hepatocitos uniformes y sinusoides claros, sin esteatosis o necrosis. El bazo mantuvo una arquitectura linfoide normal, y los riñones demostraron glomérulos y estructuras tubulares intactos sin signos de nefrotoxicidad (Fig. 8k). Estos hallazgos indican la ausencia de daño orgánico detectable después del tratamiento con PRR o PRRP. En general, los datos histológicos, hematológicos y bioquímicos demostraron que los nanocomplejos de PLA-RGD-KA26-RNA, solos o en combinación con el bloqueo de PD-L1, exhibieron un perfil de seguridad sistémica favorable sin toxicidad detectable, lo que respalda su potencial de traslación para la terapia contra el cáncer in vivo.

Síntesis y caracterización de nanopartículas de PLA

Para los sistemas de administración terapéutica de siRNA in vitro e in vivo, desarrollamos nanopartículas novedosas basadas en PLA y formulaciones de péptidos de penetración celular (CPP) utilizando nanopartículas de PLA (PLA-NP) y PLA-RGD-NP. Se ha demostrado que estas plataformas poliméricas son eficaces para la administración de vacunas [^[22]]. Los núcleos de PLA están rodeados de moléculas hidrófobas; sin embargo, los siRNA no se incorporan fácilmente en las micelas porque son hidrofílicos. Para superar estos desafíos, modificamos nuestro enfoque, pasando de la encapsulación de ARN a la unión de los siRNA a la superficie de la nanopartícula de PLA. Dado que tanto las nanopartículas como los siRNA tienen carga negativa, su unión y estabilidad no son significativas debido a las cargas superficiales; por lo tanto, utilizamos péptidos catiónicos como intermediarios para ayudar a que se adhieran y cambiar la carga superficial. En particular, probamos WA30 y KA26, dos péptidos de penetración celular (CPP) cargados positivamente conocidos por sus capacidades de condensación de ácidos nucleicos (Fig. 2a–c). Se espera que estos péptidos formen estructuras anfipáticas helicoidales, que son beneficiosas para la entrada celular y la ruptura de la membrana. Primero, preparamos poliplexos de péptido/siRNA (Fig. 2b) y los unimos a las superficies de PLA-NP y PLA-RGD-NP (Fig. 2a) para formar nanocomplejos estables (Materiales y métodos) (Fig. 2c). Las imágenes de TEM de PLA, PLA-RGD y PLA-RGD-KA26-RNA se muestran en la Fig. 2d–f, y los resultados demuestran que las nanopartículas se prepararon con éxito. El tamaño de partícula y la morfología sugieren una acumulación favorable en los sitios tumorales. Se utilizó la dispersión de luz dinámica (DLS) para determinar las propiedades de la formulación (Fig. 2g) de las nanopartículas preparadas. Las nanopartículas de PLA no modificadas tenían aproximadamente 179 nm de diámetro y un potencial zeta de -22 mV (Fig. 2h). Cuando se adsorbió el poliplexo, la carga superficial de las nanopartículas cambió a aproximadamente +25 mV (Fig. 2h), y el tamaño de partícula aumentó, lo que indica que los complejos péptido/siRNA recubrieron eficazmente las nanopartículas. PLA formó los nanocomplejos más grandes (aproximadamente 179 nm), mientras que PLA-KA26-RNA, PLA-RGD y PLA-RGD-KA26-RNA (PRR) formaron nanocomplejos más grandes (aproximadamente 202, 209 y 225 nm, respectivamente). Todas las formulaciones tenían bajos índices de polidispersidad (PDI ≈ 0,1), lo que indica que las partículas tenían aproximadamente el mismo tamaño (Fig. 2g). Se probaron las formulaciones para la estabilidad durante al menos 7 días a 4 °C (Fig. 2i). Como se muestra en la Fig. 2i, el tamaño se mantuvo igual en diferentes disolventes. Nuestros hallazgos validan que se pueden preparar siRNA estables y nanocomplejos de siRNA utilizando nanopartículas basadas en PLA y CPP. Los péptidos de penetración celular mantuvieron su capacidad para condensar los ácidos nucleicos incluso después de unirse a las nanopartículas, lo que indica su potencial para su uso en sistemas de administración de ARN.

Captación celular y eficiencia de administración in vivo de las formulaciones de PLA-RNA

Para la captación y la internalización celular, utilizamos microscopía confocal de barrido láser (CLSM) y citometría de flujo para determinar el alcance con el que los nanocomplejos de PLA-WA30-RNA y PLA-KA26-RNA@Cy5 entraron en las líneas celulares tumorales RKO y MC38 y administraron ARN a las células. Se utilizó ARN etiquetado con Cy5 en un modelo de seguimiento de fluorescencia de la vía de captación de ARN terapéutico [^[23]]. Después de 4 horas de incubación, la intensidad de fluorescencia intracelular roja aumentó notablemente, particularmente en el grupo de tratamiento con PLA-KA26-RNA@Cy5 (Fig. 3a–b), lo que indica una internalización celular rápida y eficiente de la formulación. Como se muestra en la Fig. 3a–b, el grupo PLA-KA26-RNA@Cy5 exhibió la intensidad de fluorescencia más alta en comparación con el grupo de ARN desnudo. PLA-KA26-RNA@Cy5 exhibió la fluorescencia intracelular más fuerte en las líneas celulares MC38 y RKO. Estos resultados también sugieren que PLA-KA26-RNA@Cy5 tiene mejores efectos de internalización y administración que PLA-WA30-RNA@Cy5. En contraste, el grupo de Cy5@RNA desnudo mostró casi ninguna fluorescencia roja en ninguna de las líneas celulares en ningún momento, porque el ARN no formulado tiene carga negativa y es hidrofílico, lo que dificulta su absorción por las células (Fig. 3a–b).

Para evaluar aún más la eficiencia de administración intracelular de las diferentes formulaciones de siRNA, se realizó un análisis de citometría de flujo utilizando nanopartículas de PLA cargadas con siRNA etiquetadas con Cy5 en células MC38. Preparamos NP con péptido RGD, PLA-KA26-RNA@Cy5, PLA-RGD-KA26-RNA@Cy5, PLA-WA30-RNA@Cy5 y PLA-RGD-WA30-RNA@Cy5, y evaluamos su rendimiento de captación celular. Como se muestra en las superposiciones del histograma (Fig. 3c–g), todas las formulaciones de nanopartículas exhibieron una captación celular considerable en comparación con el control (ARN desnudo). Entre las formulaciones experimentales, PLA-RGD-KA26-RNA@Cy5 demostró la mayor captación celular (69,87%), que fue significativamente mayor que la de las otras formulaciones (p < 0,01 en comparación con PLA-WA30-RNA y PLA-KA26-RNA). PLA-KA26-RNA@Cy5 también logró una captación sustancial, alcanzando el 58,33%, mientras que PLA-RGD-WA30-RNA@Cy5 y PLA-WA30-RNA@Cy5 demostraron eficiencias de captación del 59,69% y el 35,41%, respectivamente (Fig. 3c–g). El análisis cuantitativo de la intensidad media de fluorescencia (IMF), resumido en el gráfico de barras (Fig. 3h), confirmó aún más que la incorporación del péptido RGD mejoró notablemente la internalización celular, especialmente en la formulación de PLA-RGD-KA26-RNA. La modificación dirigida utilizando RGD, que mejora la endocitosis mediada por receptores a través de la unión a la integrina, probablemente contribuyó a un mejor rendimiento [^[24],^[25]]. Estos resultados demuestran que todas las formulaciones de nanopartículas de siRNA basadas en PLA administran ARN de manera eficiente a las células. Sin embargo, PLA-RGD-KA26-RNA@Cy5 superó a todas las demás formulaciones probadas en términos de captación celular y es un vehículo de administración altamente prometedor para terapias basadas en siRNA dirigidas a células tumorales que sobreexpresan integrinas. PLA-RGD-KA26-RNA se seleccionó para análisis posteriores.

Para evaluar la biodistribución in vivo y la eficiencia de direccionamiento tumoral de las nanopartículas PLA-RGD-KA26-RNA, se establecieron modelos murinos de metástasis pulmonar CT-26-luciferasa (CT-26-luc) (Fig. 3i). Se compararon dos formulaciones: PLA-KA26-RNA@Cy5 (no dirigida) y PLA-RGD-KA26-RNA@Cy5 (dirigida con el péptido RGD). El etiquetado fluorescente con Cy5 permitió el seguimiento en tiempo real de la distribución de las nanopartículas después de la inyección intravenosa mediante imágenes in vivo en múltiples puntos temporales (0, 4, 12, 24 y 48 h). Como se muestra en la Fig. 3j, la señal de fluorescencia en los ratones tratados con PLA-RGD-KA26-RNA@Cy5 fue significativamente mayor en la región pulmonar, especialmente a las 4 y 12 h después de la inyección, lo que indica la acumulación eficiente de la formulación dirigida en el sitio de las metástasis pulmonares. En contraste, el grupo PLA-KA26-RNA@Cy5 (no dirigida) mostró una señal de fluorescencia mucho más débil y más dispersa, lo que sugiere un direccionamiento tumoral limitado y una biodistribución inespecífica. A las 24 h, la señal en el grupo PLA-RGD permaneció concentrada en la región torácica, mientras que se redujo considerablemente en el grupo no dirigido. A las 48 h, solo quedaban señales mínimas en ambos grupos, lo que indica la eliminación de las nanopartículas de la circulación.

La Fig. 3k muestra imágenes fluorescentes de los principales órganos (pulmón, hígado, bazo, corazón y riñón) obtenidas 48 h después de la inyección. El grupo que recibió PLA-RGD-KA26-RNA@Cy5 exhibió una fluorescencia mucho mayor en los tejidos pulmonares, lo que sugiere que el fármaco se acumuló más en los sitios de metástasis pulmonares. En contraste, el grupo PLA-KA26-RNA@Cy5 mostró una fluorescencia débil en todos los órganos, y solo se observó una pequeña cantidad de localización específica en el pulmón. Esta diferencia indica que el direccionamiento activo mediado por RGD es eficaz contra los tumores metastásicos en los pulmones. El análisis cuantitativo de la región de interés (ROI) a partir de las imágenes in vivo (Fig. 3l) validó aún más estos resultados. El grupo PLA-RGD-KA26-RNA@Cy5 exhibió valores de ROI significativamente más altos a las 4 y 12 h que el grupo no dirigido, lo que confirma una mayor acumulación tumoral. Después de 24 h, se observó fluorescencia en ambos grupos; sin embargo, el grupo dirigido exhibió una señal más fuerte en los pulmones. La Fig. 3m muestra la biodistribución de las señales fluorescentes en los órganos recolectados. La escala logarítmica reveló que PLA-RGD-KA26-RNA@Cy5 se acumuló en los pulmones en aproximadamente una magnitud mayor que en los otros órganos principales. En contraste, el grupo PLA-KA26-RNA@Cy5 exhibió una señal más uniformemente distribuida, lo que indica una captación inespecífica y un direccionamiento tumoral limitado. Estos resultados demuestran que el sistema de nanopartículas PLA-RGD-KA26-RNA funcionalizado con RGD mejora significativamente la administración a los tumores pulmonares metastásicos in vivo mediante un direccionamiento activo. Estos hallazgos validan la superioridad de la formulación dirigida sobre el sistema no dirigido para la administración específica de ARN a los tumores y respaldan su potencial para la aplicación terapéutica en el cáncer colorrectal metastásico.

Eficiencia de silenciamiento de NSUN2-siRNA y regulación descendente dependiente de la dosis mediante nanocomplejos PRR

Para evaluar la eficacia de NSUN2 en el silenciamiento y la regulación descendente del microambiente tumoral (Fig. 4a). Se desarrollaron tres candidatos de siRNA distintos (siRNA1, siRNA2 y siRNA3) dirigidos a NSUN2 para determinar la secuencia más eficaz para el silenciamiento génico (Fig. 4b) (Tabla 2). Los siRNA se transfectaron en células CT-26 (Fig. 4c). Se utilizó Western blot (Fig. 4c) para evaluar la eficacia del silenciamiento a nivel de la proteína. Todos los siRNA mostraron excelentes efectos de silenciamiento, siendo el siRNA1 el que demostró el efecto de silenciamiento más significativo, disminuyendo marcadamente los niveles de proteína NSUN2 en relación con los de los controles normales (NC) y las células tratadas con otros siRNA. La imagen cualitativa del blot indicó una reducción significativa en la intensidad de la banda NSUN2 para el siRNA1 en comparación con la de los siRNA2 y siRNA3. Esto indica que el siRNA1 fue más eficaz para inhibir la síntesis de proteínas. El análisis densitométrico cuantitativo normalizado a tubulina (control de carga) corroboró estos resultados (Fig. 4d). El grupo siRNA1 tuvo una proporción NSUN2/tubulina mucho más baja, con aproximadamente un 87% de silenciamiento, en comparación con el grupo de control (p < 0,01). En contraste, el siRNA2 resultó en una disminución moderada (aproximadamente un 40% de silenciamiento), lo que fue estadísticamente significativo en comparación con el NC (p < 0,05). El siRNA3 exhibió una reducción mínima y no fue estadísticamente diferente del control (ns, p > 0,05). Estos resultados confirmaron que el siRNA1 es la secuencia más eficaz para el silenciamiento de NSUN2 en las células CT-26. Las secuencias específicas de los tres siRNA se muestran en la Fig. 4b. Basándose en los datos cualitativos y cuantitativos, se seleccionó siNSUN2-1 para una posterior formulación terapéutica en el sistema de administración PLA-RGD-KA26-RNA (PRR).

Para confirmar aún más la eficacia del silenciamiento génico de los nanocomplejos PRR (cargados con siRNA1), realizamos una PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) para examinar la expresión de ARNm de NSUN2 en las líneas celulares de cáncer colorrectal CT-26 y HCT-116. Las células se trataron con la formulación de nanocomplejos (denominada PRR) durante 36 h, después de lo cual se extrajo el ARN total y se cuantificaron los niveles de ARNm utilizando β-actina como gen de referencia interno. Se observó una marcada supresión de la expresión de NSUN2 mediante qPCR en ambos tipos de células después del tratamiento con PRR (Fig. 4e-f). Esto subraya la eficacia de la administración de siRNA y el silenciamiento génico. La expresión de NSUN2 se redujo significativamente después del tratamiento con PRR, con niveles relativos de ARNm que disminuyeron de 1,00 ± 0,25 veces en el grupo de control a aproximadamente 0,38 ± 0,20 veces después del tratamiento, lo que corresponde a una reducción de aproximadamente el 60% en la expresión (p < 0,05, n = 3) (Fig. 4e). De manera similar, en las células HCT-116 (Fig. 4f), el tratamiento con PRR condujo a una supresión pronunciada de la expresión de NSUN2. Los niveles relativos de ARNm se redujeron de 1,00 ± 0,03 veces en las células de control a aproximadamente 0,45 ± 0,06 veces en el grupo tratado, lo que representa una disminución de aproximadamente el 55% en los niveles de transcripción (p < 0,001, n = 3).

Para validar la eficacia del silenciamiento de los nanocomplejos PRR, las células de cáncer CT-26 y HCT-116 se trataron con concentraciones crecientes de ARN en los nanocomplejos (0,625, 1,25, 2,5, 5 y 10 μL). El análisis de Western blot (Fig. 4g-h) reveló una reducción dependiente de la concentración en los niveles de proteína NSUN2 en ambas líneas celulares. La tubulina se utilizó como control de carga y referencia de normalización. En las células CT-26 (Fig. 4g), se observó una marcada disminución en la expresión de NSUN2 a partir de 1,25 μL, con una regulación descendente significativa evidente a 2,5 μL y un silenciamiento casi completo a 5 y 10 μL. El análisis de Western blot (Fig. 4h) cuantificó esta tendencia, lo que indica que la relación NSUN2/tubulina disminuyó a aproximadamente el 48% a 2,5 μL y aproximadamente el 17,2% y el 13% a 5 y 10 μL, respectivamente, en comparación con los controles no tratados (establecidos en 100%). La regulación descendente fue estadísticamente significativa (p < 0,01 a 5 μL y p < 0,001 a 10 μL), lo que indica un potente efecto dependiente de la dosis. La visualización del mapa de calor (Fig. 4i) corroboró estos hallazgos, demostrando una mayor supresión a dosis más altas, particularmente a volúmenes de 5 y 10 μL.

De manera similar, en las células HCT-116 (Fig. 4j), se observó una disminución dependiente de la dosis en la expresión de NSUN2. Los resultados de nuestro experimento indicaron un silenciamiento significativo a 1,25 μL y una supresión pronunciada a 5 y 10 μL. El análisis cuantitativo (Fig. 4k) mostró que los niveles de NSUN2 fueron aproximadamente el 47,75% y el 34% de los niveles de control a 5 y 10 μL, respectivamente. Esta disminución fue estadísticamente significativa (p < 0,01) solo a la dosis más alta. El mapa de calor en la Fig. 4l muestra una tendencia de supresión similar a la observada en las células CT-26, lo que confirma que el impacto del silenciamiento también se puede observar en otras líneas celulares. Estos resultados fueron consistentes con los datos de selección de secuencias de siRNA anteriores, que indicaron que el siRNA1 demostró la mayor eficacia de silenciamiento (Fig. 4). Estos hallazgos respaldan firmemente la hipótesis de que los nanocomplejos PRR facilitan eficazmente la administración de siRNA a las células, lo que conduce a un silenciamiento eficiente y dependiente de la dosis de NSUN2. Estos resultados destacan las ventajas de PRR como un nanocargador viable para el tratamiento basado en la interferencia de ARN (RNAi), particularmente en las malignidades en las que NSUN2 desempeña un papel fundamental.

Las nanopartículas dirigidas inhiben la migración de las células cancerosas

Para evaluar aún más el potencial antimigratorio de los nanocomplejos PRR, se realizaron ensayos de migración Transwell utilizando dos líneas celulares de cáncer colorrectal: HCT-116 y CT-26. Las células se trataron con PBS (control), PR (no dirigido) o PRR (dirigido). Las células se tiñeron con cristal violeta y se calculó el número de células migradas. Se observó un gran número de células migradas tanto en los grupos tratados con PR como en el grupo de control (Fig. 5a). Se observó un gran número de células teñidas de cristal violeta en la membrana de Transwell mediante microscopía. Esto indicó el fuerte comportamiento migratorio de los grupos de células no tratadas y tratadas con PR. En contraste, el grupo tratado con PRR mostró menos células migradas, con solo unas pocas células débilmente teñidas observadas (Fig. 5a). Estos resultados indicaron una inhibición significativa de la migración celular. El examen visual de estas imágenes confirmó el nivel cuantitativo, donde el grupo tratado con PRR mostró una disminución de casi 4,2 veces en el número de células migradas en comparación con el control (p < 0,0001) y una disminución de 2,3 veces en comparación con el grupo PR (p < 0,01) (Fig. 5b). Estos resultados respaldan firmemente la conclusión de que la administración dirigida por RGD a través del nanocomplejo PRR previene eficazmente la migración de las células de carcinoma colorrectal HCT-116. De manera similar a la línea celular HCT-116, se observó una tendencia comparable en la línea celular CT-26. Tanto el grupo de control como el grupo PR mostraron altos niveles de migración en el presente estudio. Sin embargo, las células tratadas con el nanocomplejo PRR mostraron una migración marcadamente reducida, con menos células y una tinción más clara en la superficie de la membrana (Fig. 5b). El examen visual de estas imágenes se confirmó a nivel cuantitativo, donde el grupo tratado con PRR mostró una reducción de aproximadamente 3,5 veces en el número de células migradas en comparación con el grupo de control (p < 0,001) y una disminución de aproximadamente 1,8 veces en relación con el grupo PR (p < 0,01) (Fig. 5d). Cabe destacar que no hubo una diferencia significativa entre los grupos de control y PR (ns, p > 0,05), lo que destaca la importancia de la funcionalización con RGD para lograr efectos terapéuticos.

Para corroborar el efecto antimigratorio observado en el ensayo de migración Transwell, se realizó un ensayo de curación de heridas por rascado utilizando células CT-26. Después de crear un rascado suave en monocapas de células, las células se trataron con PBS (control), PR no dirigido o nanocomplejos PRR dirigidos. Se capturaron imágenes del cierre de la herida a las 0, 24, 48 y 72 h después del tratamiento (Fig. 5e). Las células tratadas con PBS y PR mostraron una reparación gradual de la herida con el tiempo, con un cierre significativo observado en el grupo de control a las 72 h después de la lesión. En contraste, las células tratadas con PRR mostraron un retraso marcado en la curación de la herida, con el área del rascado permaneciendo en gran parte abierta durante 72 h. Un estudio cuantitativo del cierre de la herida (Fig. 5g) demostró una disminución estadísticamente significativa en la capacidad migratoria del grupo tratado con PRR en todos los puntos temporales posteriores al tratamiento. Después de 24 h, el porcentaje de cierre de la herida fue de solo el 5% en el grupo PRR, mientras que fue del 22% en el grupo PR y del 21% en el grupo PBS (p < 0,0001). Después de 48 h, las células tratadas con PRR curaron solo el 15% de sus heridas, mientras que las tratadas con PR y control curaron el 34% y el 46%, respectivamente (p < 0,0001 PRR frente a control, p < 0,05 PRR frente a PR). A las 72 h, PRR exhibió una tasa de cierre sustancialmente deteriorada del 15%, en contraste con el 44% en el grupo PR y el 53% en el grupo de control (p < 0,0001 para ambas comparaciones).

Para evaluar si la sobreexpresión de NSUN2 influye en los efectos antimigratorios de los nanocomplejos de siRNA basados en PLA, se realizó un ensayo de curación de heridas mediante el rascado de células transfectadas con un plásmido de sobreexpresión de NSUN2. Los grupos experimentales incluyeron aquellos tratados con PR, PRR y un grupo tratado con PBS como control positivo (Fig. 5f). A las 24 horas después del rascado, el cierre de la herida en el grupo control progresó a aproximadamente el 32%, mientras que las células tratadas con PR y PRR mostraron tasas de cierre significativamente reducidas, de aproximadamente el 18% y el 10%, respectivamente. Después de 48 horas de tratamiento, la brecha en el grupo control fue de aproximadamente el 53%, mientras que la brecha en las células tratadas con PR y PRR fue de aproximadamente el 44% y el 29%, respectivamente. El grupo control mostró un 75% de cierre de la herida después de 72 horas, mientras que las células tratadas con PR cerraron el 50% de la herida, y el grupo tratado con PRR permaneció mayormente cerrado en un 32%. El análisis estadístico demostró que el tratamiento con PRR inhibió significativamente la curación de la herida en todos los puntos temporales en comparación con el grupo control (p < 0,0001). PRR suprimió constantemente la migración celular a las 24 horas (p < 0,01), 48 horas (p < 0,01) y 72 horas (p < 0,0001), lo que destaca la eficacia antimigratoria superior de los nanocomplejos funcionalizados con RGD (Fig. 5h). Para evaluar el potencial antimigratorio de las nanopartículas PRR, se realizó un ensayo de curación de heridas (rascado) utilizando una variedad de concentraciones de nanopartículas (0,625, 1,25, 2,5, 5 y 10 μL). Se capturaron imágenes microscópicas a las 0, 24, 48 y 72 horas después del tratamiento para controlar el cierre del área de raspado a lo largo del tiempo (Fig. 5j). En el grupo control no tratado, las células exhibieron una migración rápida, con un cierre casi completo de la herida observado a las 72 horas. En contraste, los grupos tratados con PRR demostraron una inhibición dependiente de la concentración de la migración celular. A concentraciones más bajas (0,625 μL y 1,25 μL), se observó un cierre parcial de la herida a las 72 horas, lo que indica una supresión leve de la actividad migratoria. Sin embargo, a concentraciones más altas (2,5 μL a 10 μL), el cierre de la herida siguió siendo significativamente deficiente incluso después de 72 horas, con el área de raspado claramente visible en comparación con el grupo control. Estos resultados indicaron que las nanopartículas PRR inhibieron eficazmente la migración de las células cancerosas de manera dependiente de la dosis (Fig. 5k). La marcada reducción en la curación de la herida a concentraciones más altas de nanopartículas sugiere un fuerte efecto antimigratorio, posiblemente relacionado con el silenciamiento dirigido de NSUN2 y la interrupción de las vías de motilidad celular (Fig. 5i).

Diseño del modelo terapéutico in vivo para metástasis pulmonar

Para investigar el potencial terapéutico de las formulaciones de nanopartículas cargadas con ARN en el cáncer colorrectal metastásico, se utilizó un modelo de ratón BALB/c inmunocompetente de metástasis pulmonar. Las células CT-26 que expresan de forma estable la luciferasa (CT-26/Luc) se administraron mediante inyección en la vena de la cola a una dosis de 1 × 105 células por ratón el día 0 para iniciar la colonización pulmonar. El día 10, cuando se habían formado nódulos metastásicos, los ratones se asignaron aleatoriamente a los grupos de tratamiento (n = 3 por grupo) y recibieron inyecciones intravenosas de las siguientes formulaciones: PR, PRR, anticuerpo anti-PD-L1 (PD-L1), un tratamiento combinado (PRRP: PRR + anticuerpo anti-PD-L1) o PBS como control no tratado (Fig. 6a). Cada tratamiento se administró a una dosis equivalente a 2 μg de ARN por gramo de peso corporal y se administró por vía intravenosa los días 11, 14, 17, 20 y 24 después de las lesiones. La progresión tumoral se controló de forma no invasiva mediante imágenes bioluminiscentes con el sistema Xenogen IVIS Spectrum después de la inyección intraperitoneal de D-luciferina. El día 28, se sacrificaron los ratones y se recolectaron los tejidos pulmonares para la obtención de imágenes al final del estudio y la cuantificación de la carga tumoral.

La eficacia terapéutica de los nanocomplejos PRR se evaluó en un modelo de metástasis pulmonar establecido utilizando ratones BALB/c. Cada ratón recibió una inyección intravenosa de 1,5 × 105 células CT-26 que expresan de forma estable la luciferasa (CT-26-Luc) a través de la vena de la cola para promover la colonización metastásica en los pulmones. Una vez que se generó el tumor, se confirmó mediante imágenes bioluminiscentes in vivo (Fig. 6a). Todos los ratones recibieron al menos cinco dosis en 18 días. Se realizaron imágenes bioluminiscentes (BLI) los días 0, 10 y 18, a partir de la primera dosis, para controlar la progresión del tumor (Fig. 6b). Los ratones en los grupos de control y PR mostraron un crecimiento tumoral rápido y agresivo. En contraste, los grupos PRR y PRRP mostraron una supresión significativa de las señales tumorales, con la reducción más pronunciada observada en el grupo de combinación PRRP (Fig. 6c). El análisis cuantitativo de ROI (región de interés) confirmó que los grupos PRRP y PRR mostraron una reducción significativa en la intensidad de la bioluminiscencia el día 18, que fue significativamente menor que la de los grupos de control y PR (p < 0,001).

Los pulmones se recolectaron al final del estudio (día 28) para la evaluación morfológica general (Fig. 6d) con el fin de investigar más a fondo la eficacia antimetastásica de la terapia combinada. Los pulmones de los ratones del grupo de control y del grupo tratado con PR tenían una alta carga de nódulos metastásicos. Sin embargo, los ratones tratados con PRR y PRRP parecían en gran medida normales. Numerosos nódulos pulmonares metastásicos (Fig. 6e) corroboraron este hallazgo. El grupo PRR (media de 65 nódulos) mostró una reducción significativa, y el número fue el más bajo en el grupo PRRP (30 nódulos) en comparación con más de 150 nódulos en el grupo de control (p < 0,001 para PRR y PRRP frente al control) (Fig. 6e). Estos datos demuestran que la administración dirigida de siRNA de NSUN2 a través de los nanocomplejos PRR inhibe eficazmente la progresión tumoral y la metástasis pulmonar, con una mayor mejora observada cuando se combina con la terapia de bloqueo del punto de control inmunitario PD-L1.

Después de investigar la carga de cáncer de pulmón metastásico in vivo, se recolectaron los pulmones y se realizaron imágenes bioluminiscentes ex vivo (BLI) al final del estudio (día 28). Los pulmones de los grupos de control y PR exhibieron una intensa bioluminiscencia. Esto indica una alta carga de tumores metastásicos (Fig. 6f). De manera similar, se observó una luminiscencia moderada en el grupo de monoterapia con PD-L1, lo que sugiere una inhibición parcial del crecimiento metastásico. En contraste, los grupos PRR y PRR + PD-L1 mostraron una luminiscencia significativamente reducida. El grupo PRR + PD-L1 demostró la intensidad de bioluminiscencia más baja entre todos los grupos, lo que indica una supresión casi completa de las señales asociadas con el tumor (Fig. 6f). Estos hallazgos se confirmaron mediante el análisis cuantitativo de la región de interés (ROI) en los tejidos pulmonares (Fig. 6g). Entre las comparaciones de grupos, el grupo PRR mostró una señal luminiscente significativamente reducida en comparación con el grupo de control (p < 0,001). Sin embargo, PRR + PD-L1 condujo a una disminución >80% en el flujo de fotones en comparación con el control (p < 0,0001). Estos resultados demuestran la eficacia terapéutica superior de los nanocomplejos PRR en la reducción de la carga de tumores metastásicos pulmonares, particularmente cuando se combinan con la inhibición del punto de control inmunitario.

Se controlaron los pesos corporales de los ratones durante todo el período del estudio durante las investigaciones terapéuticas in vivo. El propósito de este estudio fue evaluar la tolerabilidad sistémica y el estado general de salud (Fig. 6h). Se observó una disminución gradual del peso corporal en todos los grupos de tratamiento y control. Esto probablemente se deba a la carga tumoral, el estrés metabólico relacionado con la enfermedad y el estrés oxidativo, lo que conduce a una reducción del apetito en los pacientes con cáncer. Este es un fenómeno común en el cáncer [^[26], ^[27]]. Inicialmente, los ratones en los grupos PRR y PRRP mostraron pérdida de peso; sin embargo, se observó un aumento gradual del peso corporal a partir del día 18 (Fig. 6h). Esta estabilización y recuperación del peso corporal se correlacionaron con una reducción de la carga tumoral. En contraste, los ratones tratados con PBS (control), PR y anticuerpo de monoterapia con PD-L1 mostraron pérdida de peso durante todo el período del estudio. Estos hallazgos subrayan la eficacia terapéutica de PRR y PRRP y destacan sus perfiles de seguridad favorables, como lo demuestra el mantenimiento o la mejora del peso corporal, un punto final crítico en los estudios preclínicos de oncología [^[28], ^[29]]. La terapia PRR, particularmente en combinación con PD-L1, ofrece las ventajas duales de una potente actividad antitumoral y una toxicidad sistémica mínima.

Análisis inmunohistoquímico de la regresión tumoral y la activación inmunitaria después del tratamiento

Aunque los resultados in vitro e in vivo fueron significativamente positivos, los mecanismos moleculares subyacentes responsables de la eficacia terapéutica observada in vitro e in vivo deben ser dilucidados. Se evaluó la expresión de NSUN2 ex vivo en los tejidos pulmonares recolectados de los ratones. El análisis de PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) reveló una reducción significativa en la expresión de ARNm de NSUN2 en los grupos PRR y PRRP (Fig. 7a). En comparación con el grupo control, el tratamiento con PRR resultó en un cambio de aproximadamente 0,35 veces en los niveles de transcripción de NSUN2. En contraste, el grupo PRRP mostró una supresión significativa, con un cambio de 0,24 veces. Estos resultados indican un efecto de silenciamiento sinérgico cuando se utilizan PRR en combinación con inhibidores de puntos de control. Las mismas muestras se utilizaron para la inmunotransferencia para determinar la expresión de proteínas (Fig. 7b-c). Los grupos tratados con PRR y PRRP mostraron una disminución en la expresión de la proteína NSUN2, con el grupo PRRP mostrando la reducción más profunda en los niveles de proteína NSUN2. Por el contrario, PR y PD-L1 tuvieron solo efectos modestos o insignificantes en los niveles de expresión de NSUN2. Estos datos demuestran que las nanopartículas PRR suprimen eficazmente la metástasis pulmonar in vivo a través de la administración dirigida de siRNA de NSUN2 en combinación con PD-L1. Estos hallazgos respaldan firmemente el uso de PRR como un prometedor agente nanoterapéutico basado en ARN para el tratamiento del cáncer metastásico.

Se realizaron análisis inmunohistoquímicos integrales en los tejidos pulmonares recolectados de todos los grupos de tratamiento. La tinción con hematoxilina y eosina (H&E) reveló diferencias significativas entre los grupos. Los tejidos pulmonares del grupo control mostraron células tumorales densamente agregadas caracterizadas por una atipia nuclear significativa, una relación núcleo-citoplasma elevada y una arquitectura alveolar gravemente comprometida, lo que indica una proliferación agresiva y metastásica (Fig. 7d). Los tejidos de los grupos de monoterapia con PR y PD-L1 (Fig. 7d) exhibieron una ligera disminución de la carga tumoral, acompañada de una restauración parcial de las estructuras alveolares y características de apoptosis dispersas. En el grupo PRR (Fig. 7d), el tumor se redujo notablemente, con áreas claras de necrosis y grupos tumorales más pequeños observados. De manera notable, las secciones pulmonares del grupo de terapia combinada (PRRP) (Fig. 7d) exhibieron una resolución casi completa de las lesiones tumorales, con una morfología de los tejidos que se asemejaba estrechamente a la del parénquima pulmonar sano y una mínima metástasis residual. Estos hallazgos histopatológicos respaldan firmemente la eficacia antitumoral mejorada lograda a través de la estrategia dual de administración dirigida de ARN y bloqueo del punto de control inmunitario, lo que destaca el potencial terapéutico de este enfoque combinatorio para el tratamiento del cáncer colorrectal metastásico.

Reclutamiento de células T

Hemos medido la actividad inmune mediante la tinción para células T CD4+ y CD8+. En el grupo de control, las señales de CD4+ y CD8+ fueron moderadas y bajas, respectivamente, lo que indica una activación inmune débil. Tanto las terapias con PD-L1 como con PR aumentaron ligeramente los niveles de células T, aunque la infiltración siguió siendo modesta. El grupo PRR mostró un aumento significativo de las células T CD8+, lo que indica una respuesta antitumoral más fuerte que la de los otros grupos. Esto probablemente se deba al silenciamiento de NSUN2, lo que mejora la presentación del antígeno. La respuesta más fuerte se observó en el grupo PRRP (Fig. 7e-f). Este grupo exhibió la mayor infiltración tanto de células T CD4+ (Fig. 7g) como de células T CD8+ (Fig. 7h). Con base en estos resultados, el tratamiento activó una respuesta inmune adaptativa robusta y eliminó los tumores mediante la actividad de las células T. Como se muestra en la Fig. 7i, la relación CD4+/CD8+ fue estadísticamente significativa. El aumento del reclutamiento de células T en los pulmones demostró el efecto inmunomodulador de la combinación del nanocomplejo PRR y el bloqueo de PD-L1. Esto ocurre a través de vías tanto intrínsecas al tumor (silenciamiento de NSUN2) como de inhibición externa de los puntos de control inmunitario.

Índice de proliferación Ki67: supresión del crecimiento tumoral

Se utilizó la tinción de Ki67 para evaluar la proliferación de las células tumorales en los diferentes grupos. Se observó una intensa tinción nuclear de Ki67 en los grupos de control y PR, lo que indica una alta proliferación celular. Se observó una modesta reducción de las células Ki67 positivas en el grupo de monoterapia con PD-L1, lo que refleja una supresión inmunoterapéutica parcial. En particular, se observó una disminución marcada de la expresión de Ki67 en el grupo tratado con PRR, lo que sugiere una inhibición significativa de la proliferación tumoral debido al silenciamiento de NSUN2. Este efecto se potenció aún más en el grupo PRRP, donde los núcleos Ki67 positivos eran mínimos o estaban ausentes, lo que implica una detención casi completa del crecimiento tumoral (Fig. 7j). Como se muestra en la Fig. 7l, el grupo de control exhibió señales de proliferación significativamente más altas que los grupos de tratamiento. Estos hallazgos se alinean con la regresión tumoral observada mediante la tinción con H&E y respaldan aún más el potente efecto antiproliferativo de la terapia combinada.

Ensayo TUNEL: inducción de la apoptosis

Se evaluó la muerte celular apoptótica mediante el ensayo TUNEL, en el que la fluorescencia verde indicó la fragmentación del ADN y las células apoptóticas. Los grupos de control y PR mostraron pocas o ninguna célula TUNEL positiva, lo que indica una baja actividad apoptótica basal (Fig. 7k). El grupo de PD-L1 exhibió una apoptosis moderada, lo que fue consistente con su eficacia parcial. En contraste, el grupo PRR mostró un aumento de las células TUNEL positivas, lo que indica una inducción eficaz de la muerte celular programada. El grupo PRRP también demostró un alto nivel de apoptosis; sin embargo, las señales no fueron significativamente altas (Fig. 7m). Esta observación sugiere que la combinación del silenciamiento de NSUN2 y la activación inmune puede promover sinérgicamente la muerte de las células tumorales a través de vías apoptóticas.

En conjunto, estos análisis histológicos e inmunofluorescentes proporcionan evidencia convincente de que PLA-RGD-KA26-RNA (PRR), particularmente cuando se combina con el bloqueo de PD-L1 (PRRP), ejerce efectos antitumorales multimodales sobre las lesiones pulmonares metastásicas. Estos efectos incluyeron la regresión tumoral (H&E), el aumento de la infiltración de células T (CD4+ y CD8+), la supresión de la proliferación (Ki67) y el aumento de la apoptosis (TUNEL). El beneficio terapéutico más sustancial se observó en el grupo PRRP, lo que enfatiza el potencial de la inmunonanoterapia combinada dirigida a los reguladores epigenéticos, como NSUN2, junto con los puntos de control inmunitario. Estos hallazgos refuerzan la promesa de esta estrategia para el tratamiento de cánceres metastásicos inmunorresistentes y proporcionan una base sólida para la futura traslación clínica.

Reclutamiento de células T

Hemos medido la actividad inmune mediante la tinción para células T CD4+ y CD8+. En el grupo de control, las señales de CD4+ y CD8+ fueron moderadas y bajas, respectivamente, lo que indica una activación inmune débil. Tanto las terapias con PD-L1 como con PR aumentaron ligeramente los niveles de células T, aunque la infiltración siguió siendo modesta. El grupo PRR mostró un aumento significativo de las células T CD8+, lo que indica una respuesta antitumoral más fuerte que la de los otros grupos. Esto probablemente se deba al silenciamiento de NSUN2, lo que mejora la presentación del antígeno. La respuesta más fuerte se observó en el grupo PRRP (Fig. 7e-f). Este grupo exhibió la mayor infiltración tanto de células T CD4+ (Fig. 7g) como de células T CD8+ (Fig. 7h). Con base en estos resultados, el tratamiento activó una respuesta inmune adaptativa robusta y eliminó los tumores mediante la actividad de las células T. Como se muestra en la Fig. 7i, la relación CD4+/CD8+ fue estadísticamente significativa. El aumento del reclutamiento de células T en los pulmones demostró el efecto inmunomodulador de la combinación del nanocomplejo PRR y el bloqueo de PD-L1. Esto ocurre a través de vías tanto intrínsecas al tumor (silenciamiento de NSUN2) como de inhibición externa de los puntos de control inmunitario.

Índice de proliferación Ki67: supresión del crecimiento tumoral

Se utilizó la tinción de Ki67 para evaluar la proliferación de las células tumorales en los diferentes grupos. Se observó una intensa tinción nuclear de Ki67 en los grupos de control y PR, lo que indica una alta proliferación celular. Se observó una modesta reducción de las células Ki67 positivas en el grupo de monoterapia con PD-L1, lo que refleja una supresión inmunoterapéutica parcial. En particular, se observó una disminución marcada de la expresión de Ki67 en el grupo tratado con PRR, lo que sugiere una inhibición significativa de la proliferación tumoral debido al silenciamiento de NSUN2. Este efecto se potenció aún más en el grupo PRRP, donde los núcleos Ki67 positivos eran mínimos o estaban ausentes, lo que implica una detención casi completa del crecimiento tumoral (Fig. 7j). Como se muestra en la Fig. 7l, el grupo de control exhibió señales de proliferación significativamente más altas que los grupos de tratamiento. Estos hallazgos se alinean con la regresión tumoral observada mediante la tinción con H&E y respaldan aún más el potente efecto antiproliferativo de la terapia combinada.

Ensayo TUNEL: inducción de la apoptosis

Se evaluó la muerte celular apoptótica mediante el ensayo TUNEL, en el que la fluorescencia verde indicó la fragmentación del ADN y las células apoptóticas. Los grupos de control y PR mostraron pocas o ninguna célula TUNEL positiva, lo que indica una baja actividad apoptótica basal (Fig. 7k). El grupo de PD-L1 exhibió una apoptosis moderada, lo que fue consistente con su eficacia parcial. En contraste, el grupo PRR mostró un aumento de las células TUNEL positivas, lo que indica una inducción eficaz de la muerte celular programada. El grupo PRRP también demostró un alto nivel de apoptosis; sin embargo, las señales no fueron significativamente altas (Fig. 7m). Esta observación sugiere que la combinación del silenciamiento de NSUN2 y la activación inmune puede promover sinérgicamente la muerte de las células tumorales a través de vías apoptóticas.

En conjunto, estos análisis histológicos e inmunofluorescentes proporcionan evidencia convincente de que PLA-RGD-KA26-RNA (PRR), particularmente cuando se combina con el bloqueo de PD-L1 (PRRP), ejerce efectos antitumorales multimodales sobre las lesiones pulmonares metastásicas. Estos efectos incluyeron la regresión tumoral (H&E), el aumento de la infiltración de células T (CD4+ y CD8+), la supresión de la proliferación (Ki67) y el aumento de la apoptosis (TUNEL). El beneficio terapéutico más sustancial se observó en el grupo PRRP, lo que enfatiza el potencial de la inmunonanoterapia combinada dirigida a los reguladores epigenéticos, como NSUN2, junto con los puntos de control inmunitario. Estos hallazgos refuerzan la promesa de esta estrategia para el tratamiento de cánceres metastásicos inmunorresistentes y proporcionan una base sólida para la futura traslación clínica.

Seguridad in vivo

Para evaluar la seguridad sistémica y la posible toxicidad fuera del objetivo de los nanocomplejos PRR y su combinación con el bloqueo del punto de control inmunitario de PD-L1 (PRRP), se realizó una evaluación histológica exhaustiva y se realizó un análisis el día 14 posterior al tratamiento. Los ratones BALB/c (n = 3 por grupo) se dividieron en cinco grupos: PBS (control), PR, PD-L1 (anticuerpo solo), PRR y PRRP, y se les administraron sus respectivos tratamientos por vía intravenosa cada tres días, para un total de seis dosis (Fig. 8j). Al final del estudio, los ratones fueron sacrificados mediante exposición controlada a CO2, y se recolectaron los principales órganos, incluidos los pulmones, el corazón, el hígado, el bazo y los riñones, de todos los grupos experimentales. Se realizaron evaluaciones histopatológicas, hematológicas y bioquímicas séricas exhaustivas. El examen histológico de los principales órganos (pulmón, corazón, hígado, bazo y riñón) no reveló ninguna anomalía relacionada con el tratamiento en ninguno de los grupos. El análisis hematológico mostró que los recuentos de glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas se mantuvieron dentro del rango fisiológico en todos los grupos, sin diferencias estadísticamente significativas en relación con los controles. Los índices de glóbulos rojos (VCM y HCM) no cambiaron, lo que indica una eritropoyesis y morfología de los glóbulos rojos preservadas. Los marcadores bioquímicos séricos de la función renal (creatinina y BUN) y la función hepática (AST y ALT) fueron comparables en todos los grupos de tratamiento y controles, sin evidencia de deterioro renal o hepático (Fig. 8a-i). Las secciones pulmonares mostraron una arquitectura alveolar preservada sin inflamación, edema o fibrosis. Los tejidos cardíacos mostraron fibras miocárdicas intactas sin evidencia de degeneración o infiltración inflamatoria en el corazón. Las secciones hepáticas exhibieron una organización lobulillar normal con hepatocitos uniformes y sinusoides claros, sin esteatosis o necrosis. El bazo mantuvo una arquitectura linfoide normal, y los riñones demostraron glomérulos y estructuras tubulares intactos sin signos de nefrotoxicidad (Fig. 8k). Estos hallazgos indican la ausencia de daño orgánico detectable después del tratamiento con PRR o PRRP. En general, los datos histológicos, hematológicos y bioquímicos demostraron que los nanocomplejos PLA-RGD-KA26-RNA, solos o en combinación con el bloqueo de PD-L1, exhibieron un perfil de seguridad sistémica favorable sin toxicidad detectable, lo que respalda su potencial de traslación para la terapia contra el cáncer in vivo.

Discusión

El cáncer colorrectal (CCR) sigue siendo uno de los cánceres más prevalentes y letales a nivel mundial, y representa más de 1,9 millones de nuevos casos y casi 1 millón de muertes anualmente [^[30]]. A pesar de los avances en el cribado y el tratamiento, el CCR metastásico (CCRm) sigue teniendo un pronóstico sombrío, con una tasa de supervivencia a 5 años inferior al 12% una vez que se establecen las metástasis a distancia [[^[31]], [^[32]], [^[33]]]. Sin embargo, no se ha establecido bien el efecto de la edad en los resultados de supervivencia, porque el pronóstico en pacientes de edad avanzada puede verse afectado por factores como la etapa de presentación, la ubicación del tumor, las comorbilidades preexistentes y el tipo de tratamiento [^[34]]. Los biomarcadores agnósticos del tumor prometen una terapia personalizada para el CCR; sin embargo, la implementación clínica se ve limitada por las pruebas moleculares inconsistentes (debido a la variabilidad en los paneles de genes, los métodos y la bioinformática), la heterogeneidad tumoral y la resistencia adaptativa (por ejemplo, la señalización de derivación en el CCR con mutación de BRAF) y el acceso desigual a la secuenciación genómica de alto costo [^[35]]. La urgente necesidad de mejorar las estrategias terapéuticas, particularmente aquellas dirigidas a los impulsores moleculares de la progresión y la metástasis, subraya la importancia de este estudio. En este estudio, desarrollamos un nuevo sistema de administración de ARN basado en nanopartículas dirigido a NSUN2, una metiltransferasa de ARN clave que se sobreexpresa en el CCR. Evaluamos su eficacia terapéutica, sus implicaciones mecánicas y su seguridad in vitro e in vivo. Nuestros hallazgos proporcionan evidencia sólida que respalda a NSUN2 como un objetivo viable para la intervención mediada por ARN y establecen el nanocomplejo PRR como una plataforma potente para la terapia contra el cáncer.

La base para dirigir la terapia contra NSUN2 radica en su función emergente en la modificación de la RNA, específicamente en la citosina-5 metilada (m5C), y su asociación con funciones oncogénicas en múltiples tipos de cáncer, incluido el CRC [^[32],^[36],^[37]]. NSUN2 cataliza la modificación de m5C en varios sustratos de RNA, incluidos los tRNA y los mRNA, influyendo así en la estabilidad, el empalme y la traducción del RNA. En el CRC, la sobreexpresión de NSUN2 se asocia con un mal pronóstico, un mayor potencial metastásico y una mayor proliferación tumoral [^[38]]. Estudios in vitro previos realizados por nuestro grupo identificaron la modificación de tRNA-Arg en la citosina-34 (C34) mediada por NSUN2 como un evento regulador clave que protege el tRNA de la escisión y, posteriormente, promueve la progresión del cáncer a través de perfiles alterados de fragmentos derivados del tRNA (tRF) [^[39],^[40]]. Basándose en estos conocimientos, el presente estudio logró silenciar la expresión de NSUN2 utilizando un sistema de nanopartículas basado en PLA que administró directamente siRNA a los tejidos tumorales. Los análisis de Western blot y PCR cuantitativa confirmaron la significativa reducción de NSUN2 tanto a nivel de proteína como de mRNA en los tumores tratados, lo que validó la especificidad y la eficacia de nuestra estrategia de administración. Estos resultados posicionan a NSUN2 como un impulsor mecanístico de la progresión del CRC y como un objetivo terapéutico para las terapias basadas en RNA. Uno de los desafíos más importantes para traducir las terapias basadas en RNA a la práctica clínica es la administración eficiente y dirigida de moléculas de RNA a los tejidos tumorales para un tratamiento eficaz. El RNA desnudo se degrada rápidamente en el torrente sanguíneo y presenta una baja captación celular debido a su carga negativa e hidrofobicidad [^[41]]. Para superar estas limitaciones, nuestro estudio empleó una novedosa plataforma de administración de nanopartículas basada en nanopartículas de ácido poli(láctico) (PLA) biodegradables funcionalizadas con RGD y péptidos de penetración celular (KA-26). Este constructo multifuncional facilita la condensación, la protección y la administración intracelular dirigida de cargas de siRNA en las células cancerosas.

El motivo RGD, que se une a las integrinas αvβ3 sobreexpresadas en el endotelio tumoral y las lesiones metastásicas, mejora la acumulación tisular específica del nanocomplejo PRR [^[42]]. KA-26, un péptido catiónico anfifílico, facilita la liberación endosomal y citoplasmática de los siRNA. La supresión de la motilidad y la metástasis celular tras el silenciamiento de NSUN2 se validó funcionalmente utilizando tanto métodos in vitro (ensayos de transwell y de arañazo) como modelos de metástasis pulmonar in vivo. In vitro, las células tratadas con PRR mostraron una marcada disminución de la migración, con una inhibición dependiente de la dosis del cierre de la herida y la migración en el ensayo de transwell. En particular, las células sobreexpresoras de NSUN2 conservaron el potencial migratorio bajo el tratamiento de control o PR, pero no bajo la terapia PRR, lo que sugiere que la inhibición dirigida de NSUN2 revierte el fenotipo pro-metastásico asociado con la sobreexpresión de NSUN2 [^[43]].

In vivo, utilizamos un modelo de metástasis pulmonar utilizando células CT-26 marcadas con luciferasa para controlar la carga tumoral en tiempo real. Los ratones tratados con PRR y PRR + PD-L1 mostraron una intensidad de bioluminiscencia significativamente reducida, menos nódulos metastásicos y una disminución de la carga tumoral, como se confirmó mediante la imagen ex vivo. El análisis histopatológico de los pulmones reveló una regresión tumoral casi completa en el grupo PRR + PD-L1, lo que apoya aún más su efecto terapéutico sinérgico.

Los análisis de inmunofluorescencia e histológicos de los tejidos tumorales revelaron pruebas convincentes de la modulación inmune tras la terapia PRR. La infiltración de células T CD4+ y CD8+ se elevó significativamente en los tumores tratados con PRR y PRR + PD-L1, lo que sugiere que la inhibición de NSUN2 mejoró la inmunogenicidad tumoral. Además, la tinción de Ki67 mostró una supresión de la proliferación, y los ensayos TUNEL revelaron un aumento de la apoptosis en los tumores tratados con PRR, ambos indicadores de una eliminación tumoral eficaz. La combinación de PRR con el bloqueo de PD-L1 (PRRP) produjo los efectos antitumorales más robustos en todas las métricas, incluida la regresión tumoral, la infiltración de células T, la apoptosis y la supresión de NSUN2, lo que destaca el potencial sinérgico de combinar el silenciamiento génico basado en RNA con la inhibición de los puntos de control inmunitario. Esta sinergia se alinea con estudios recientes que sugieren que los moduladores epigenéticos pueden preparar los tumores para el ataque inmunitario al revertir la exclusión inmune y mejorar la presentación de antígenos.

La seguridad sistémica es una consideración crítica para las terapias basadas en RNA. El análisis de H&E de los órganos principales (pulmones, hígado, corazón, riñones y bazo) no mostró signos de inflamación, necrosis o alteración estructural en ninguno de los grupos de tratamiento, incluidos los grupos PRR y PRRP. Estos hallazgos respaldan la biocompatibilidad de los nanocargadores basados en PLA, que se consideran ampliamente plataformas seguras y biodegradables [[^[44]], [^[45]], [^[46]], [^[47]]]. La ausencia de toxicidad fuera del objetivo, junto con el mantenimiento del peso corporal y la integridad de los órganos, posiciona al sistema PRR como un candidato viable para futuras investigaciones traslacionales. La reducción de NSUN2 por PRR se asoció con una reducción significativa de los eventos de metilación de m5C, lo que es consistente con el papel conocido de NSUN2 como una metiltransferasa de RNA m5C. Estos cambios epigenéticos probablemente contribuyen a la alteración de la estabilidad y el empalme de los RNA involucrados en la regulación del ciclo celular, la proliferación y la modulación inmune. Es importante destacar que la inhibición de NSUN2 puede funcionar como una molécula de señalización en las respuestas inmunes innatas y del RNA [^[43]]. Por lo tanto, la modulación de la metilación del RNA puede tener implicaciones más amplias más allá de NSUN2, lo que podría afectar al metabolismo global del RNA y a la homeostasis celular.

Este estudio se suma al creciente conjunto de pruebas que respaldan el potencial clínico de los reguladores de la metilación del RNA como objetivos terapéuticos. Si bien los estudios anteriores se han centrado en m6A, nuestros datos destacan que m5C también desempeña un papel fundamental en el CRC, especialmente a través del impacto de NSUN2 en la escisión del tRNA y la expresión génica. Dirigir estas vías epitranscriptómicas puede ofrecer una nueva capa de control en la oncología de precisión, complementando las terapias existentes basadas en el ADN y dirigidas a las proteínas.

Aunque los resultados son prometedores, se deben reconocer varias limitaciones. En primer lugar, aunque este estudio demostró una inhibición eficaz de NSUN2 y una supresión funcional de la metástasis, el espectro completo de los objetivos y las vías posteriores influenciados por el silenciamiento de NSUN2 requiere una mayor investigación. El perfilado transcriptómico y epitranscriptómico futuro (por ejemplo, m5C-RIP-seq) podría dilucidar estas redes e identificar biomarcadores adicionales para la respuesta. En segundo lugar, aunque el sistema PRR demostró una administración eficiente y una toxicidad mínima, se requieren estudios detallados de farmacocinética y farmacodinámica para optimizar los regímenes de dosificación, evaluar la seguridad a largo plazo y comprender la distribución tisular más allá de los órganos principales. En tercer lugar, aunque la terapia combinada PRRP ha demostrado efectos sinérgicos, su potencial en tumores inmuno-refráctarios o "fríos" aún debe validarse. Los estudios futuros deben explorar su impacto en modelos inmunocompetentes con diferentes inmunogenicidades tumorales y examinar estrategias combinadas con otros inhibidores de los puntos de control inmunitario u otros moduladores del microambiente tumoral (TME). Por último, la traducción clínica requerirá la fabricación compatible con las GMP de PLA-RGD-KA26-RNA, la aprobación regulatoria para la administración de nanopartículas basada en RNA y estudios de toxicología a gran escala.

Conclusión

Este estudio presenta un sistema de administración de siRNA robusto y biocompatible que utiliza nanopartículas basadas en PLA cofuncionalizadas con péptidos RGD y KA26 para el silenciamiento génico dirigido de NSUN2 en modelos de CRC. El diseño racional del nanocomplejo PLA-RGD-KA26-RNA (PRR) permitió una mayor administración intracelular, una eficiente liberación endosomal y una acumulación tumoral específica a través de la focalización mediada por integrinas. Nuestros resultados in vitro demostraron que la formulación PRR redujo significativamente la expresión de mRNA de NSUN2 y suprimió la migración y la proliferación celular en las líneas celulares de CRC, incluidas las que sobreexpresan NSUN2. Además, los estudios in vivo utilizando un modelo de metástasis pulmonar revelaron que el tratamiento con PRR redujo sustancialmente la carga tumoral, y la mayor eficacia terapéutica se observó cuando se combinó con la terapia de bloqueo del punto de control inmunitario anti-PD-L1 (PRRP). Es importante destacar que la plataforma exhibió un fuerte perfil de seguridad sin toxicidad sistémica evidente, daño orgánico o anomalías hematológicas, incluso después de múltiples administraciones sistémicas. El análisis histológico y el perfilaje sanguíneo confirmaron la biocompatibilidad tanto de la monoterapia como de la terapia combinada. En conjunto, estos hallazgos respaldan el potencial terapéutico de las nanopartículas PRR como vehículos de administración de próxima generación para la terapia del cáncer basada en RNA, particularmente en el CRC metastásico. La sinergia observada con el bloqueo de los puntos de control inmunitario subraya aún más la promesa de las estrategias combinadas para superar la resistencia inmune y mejorar los resultados del tratamiento. Este enfoque de nanocargadores dirigidos se puede adaptar para la administración de otras terapias basadas en RNA en varios tumores sólidos, lo que ofrece una plataforma flexible para aplicaciones de medicina personalizada.

Aprobación ética

Este estudio fue aprobado por el Comité de Bienestar y Ética Animal del Laboratorio de ZJU (ZJU20241012).

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Declaración de conflicto de intereses

Los autores declaran los siguientes intereses financieros/relaciones personales que pueden considerarse posibles conflictos de intereses: Longguang Tang informa que recibió apoyo financiero del Fondo Nacional de Ciencias Naturales de China. Si hay otros autores, declaran que no tienen ningún conflicto de intereses financiero o personal conocido que pueda haber influido en el trabajo presentado en este artículo.