Un activador bispecífico de células T selectivo para p53(R273H): diseño computacional y validación funcional.

La proteína p53 es un supresor tumoral fundamental que funciona principalmente como un factor de transcripción. En respuesta a factores de estrés celular, como la hipoxia, el daño al ADN y la privación de nutrientes, p53 inicia una cascada de eventos que conducen al arresto del ciclo celular, la reparación del ADN y la restauración de la homeostasis celular normal. Cuando el daño celular excede la capacidad de reparación de la célula, p53 induce senescencia, apoptosis y reprogramación del metabolismo energético celular y las respuestas inmunitarias.^[1],^[2],^[3]
TP53, el gen que codifica la proteína p53, está mutado en más del 50% de los cánceres humanos, lo que lo convierte en uno de los genes más frecuentemente alterados en oncología.^[4],^[5],^[6],^[7] Las mutaciones en puntos críticos se agrupan dentro del dominio de unión al ADN (por ejemplo, R175H, R248W, R273H e Y220C) y, por lo general, alteran la conformación de la proteína e impiden la unión al ADN, lo que resulta en la pérdida de la función supresora tumoral junto con la adquisición de actividades oncogénicas que promueven la proliferación, la invasión y la resistencia terapéutica.^[4],^[5],^[6],^[7],^[8],^[9]

Desde principios de la década de 2000, los esfuerzos para dirigir los cánceres con mutaciones en p53 se han dividido en tres categorías amplias: (1) moléculas pequeñas, (2) terapias génicas y (3) terapias basadas en el sistema inmunitario. Las moléculas pequeñas representan la mayoría de los programas dirigidos a p53, principalmente al interrumpir las interacciones de p53 con los reguladores negativos (por ejemplo, MDM2 y MDMX) para restaurar la actividad del tipo salvaje, o al rescatar directamente la conformación de p53 mutante.^[10],^[11],^[12] Los enfoques basados en genes se han ampliado para incluir la administración de ADN plasmídico, ARN o vectores virales que codifican p53 del tipo salvaje, junto con tecnologías de edición de genes como CRISPR, editores de bases, editores primarios y meganucleasas diseñadas para corregir las mutaciones.^[13],^[14] Las estrategias basadas en el sistema inmunitario, incluidas las vacunas contra p53 y los inhibidores de puntos de control inmunitario, constituyen una tercera vía terapéutica.^[13],^[14]

A pesar de esta amplia gama de actividades, persisten importantes lagunas, particularmente para R273H, una de las variantes más comunes y biológicamente agresivas de los puntos críticos de TP53. Junto con R175H, R248W y R282W, R273H representa una proporción sustancial de todas las mutaciones de TP53 y está presente en mayor medida en cánceres de alta incidencia, incluidos los carcinomas colorrectales, de mama y de pulmón.^[15] Los tumores que portan esta mutación muestran una biología agresiva, que incluye la capacidad de formar esferoides, potencial metastásico, resistencia a la terapia y un mal pronóstico. Sin embargo, si bien existen agentes para otros puntos críticos, como APR-246 (Eprentapopt) para mutantes conformacionales como R175H, o PC14586 (Rezatapopt) para el mutante Y220C, no hay ninguna terapia de precisión específica para la mutación R273H aprobada o en fase de desarrollo avanzado. Las moléculas pequeñas que estabilizan el p53 del tipo salvaje o restauran la conformación nativa del mutante también deben hacer frente a la acelerada degradación del p53 del tipo salvaje en los tumores con mutación R273H heterocigotos, y con frecuencia carecen de especificidad para ciertas variantes.^[11],^[12],^[13],^[14],^[16] Las terapias génicas también requieren una optimización sustancial de la eficiencia y la eficacia terapéutica de la administración. Las primeras vacunas contra p53, aunque generalmente seguras e inmunogénicas, rara vez han producido respuestas tumorales objetivas, remisiones duraderas o mejoras en la supervivencia general.^[11],^[12],^[13],^[14],^[16]

Los avances en la inmunología tumoral han impulsado el desarrollo de inmunoterapias diseñadas para una mayor precisión. Las células cancerosas generan con frecuencia neoantígenos en forma de péptidos mutantes, incluidos los derivados de p53, presentados por las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) de clase I, lo que permite el reconocimiento por parte de las células T y ofrece una estrategia prometedora para la inmunoterapia dirigida.^[7],^[9] Los enfoques basados en células T se dividen en dos clases: (1) aquellos que se dirigen a las vías inmunosupresoras, como los inhibidores de puntos de control inmunitario (ICPI), y (2) aquellos que promueven las vías inmunostimulantes, incluidos las células CAR-T, las células T con receptores de células T modificados (TCR-T) y los activadores de células T bispecíficos (TCE).^[13],^[14],^[15] Los ICPI bloquean los receptores inhibidores, como la proteína de muerte celular programada 1 (PD-1) o su ligando (PD-L1), para revitalizar la actividad de las células T citotóxicas y han logrado éxito clínico en diversos tumores sólidos,^[16],^[17], aunque las tasas de respuesta se ven limitadas por la evasión inmunitaria y un microambiente tumoral supresor. Las terapias con células CAR-T y TCR-T modifican genéticamente las células T autólogas para que reconozcan los antígenos tumorales directamente, a través de receptores que acoplan un dominio de reconocimiento de antígenos extracelular a los motivos de señalización de las células T intracelulares. Su origen autólogo limita el riesgo de rechazo y autoinmunidad, pero la fabricación es costosa y lenta,^[17],^[18], mientras que su uso clínico sigue estando limitado por la persistencia limitada en los tumores sólidos y la evasión antigénica. Dirigirse específicamente a los neoantígenos de p53 se complica aún más por su origen intracelular, su presentación variable en los alelos HLA y el riesgo de reactividad cruzada con el p53 del tipo salvaje en los tejidos normales.^[3],^[6],^[7],^[17],^[19],^[20] Estas limitaciones motivan una plataforma más precisamente dirigida y restringida por HLA, en particular el desarrollo de la plataforma TCE descrita en este documento.

Los TCE, un subconjunto de anticuerpos bispecíficos (bsAb), se unen simultáneamente a las moléculas de superficie asociadas al tumor y a los receptores de activación de las células T, redirigiendo así las células T citotóxicas a las células malignas. La selección de antígenos determina la especificidad de este enfoque: los antígenos asociados al tumor (AAT) son proteínas propias que están sobreexpresadas o expresadas de forma aberrante en las células tumorales, pero que se conservan en niveles más bajos en los tejidos normales, lo que conlleva un riesgo inherente de toxicidad "on-target/off-tumor". En cambio, los antígenos específicos del tumor (AST), ejemplificados por los neoantígenos derivados de mutaciones como p53R273H, surgen exclusivamente de alteraciones somáticas, están ausentes del genoma normal y se presentan mediante el HLA de clase I únicamente en las células malignas. Esta presentación exclusiva del tumor hace que los AST sean objetivos particularmente atractivos para el diseño de TCE, lo que ofrece una ventana terapéutica más amplia y un riesgo reducido para los tejidos normales.^[21],^[22],^[23] Los activadores de células T bispecíficos (BiTE), que unen el CD3 y el AAT/AST mediante la unión simultánea, están disponibles de forma inmediata, exhiben una potencia nanomolar y han demostrado eficacia clínica en neoplasias hematológicas (por ejemplo, blinatumomab).^[24] Al conectar directamente las células T con las células tumorales mediante el reconocimiento del AST, los TCE amplifican la lisis tumoral mediada por las células T, lo que los convierte en una herramienta prometedora en la inmunoterapia contra el cáncer. Sin embargo, su aplicación a tumores sólidos, en particular los TCE que se dirigen a los complejos péptido-CMH derivados de neoantígenos, sigue siendo poco explorada, debido a los persistentes desafíos en la afinidad, la especificidad y la estabilidad.^[19],^[20],^[25]

Para abordar estas limitaciones y la necesidad clínica insatisfecha de terapias específicas para R273H, se requieren nuevas estrategias de ingeniería de proteínas. Empleamos un formato de cadena única unida, en el que un enlace disulfuro intercatenario diseñado, introducido mediante sustituciones de cisteína específicas en el sitio en la interfaz Vβ-Vα, une covalentemente dos cadenas variables en su lugar, en lugar de depender únicamente de un enlace peptídico flexible. Este "anclaje" de disulfuro evita el apareamiento y la disociación de dominios, reduce el tamaño molecular, mejora la fidelidad del plegamiento y mejora la farmacocinética sin comprometer la función de unión al antígeno.^[26] El diseño de proteínas impulsado por el aprendizaje automático (ML) complementa esto al permitir la maduración rápida de la afinidad y la optimización de la especificidad mediante la predicción y el modelado estructural iterativo.^[27],^[28],^[29] Se ha seguido una estrategia comparable para el TCE dirigido a p53 R175H, CLSP-1025, lo que demuestra la viabilidad de este enfoque para las mutaciones en puntos críticos.^[30] La integración de estas herramientas con los TCR derivados de pacientes ofrece un camino para el desarrollo de TCE de nueva generación contra neoantígenos recurrentes, como p53 R273H.^[15]

Aquí, aprovechamos un TCR que se encuentra de forma natural (TCR01) aislado de un paciente con cáncer colorrectal que presenta una mutación puntual en el gen TP53, lo que resulta en la sustitución de la arginina en el codón 273 por histidina (R273H) y el alelo HLA-C*01:02, para diseñar y optimizar una plataforma TCE contra este objetivo. Identificamos HLA-C*01:02 como el alelo principal que presenta el epítopo de 9 aminoácidos inmunodominante (SFEVHVCAC) y diseñamos variantes de TCE unidas con menor peso molecular y mayor potencia, que se refinaron aún más mediante la evolución dirigida guiada por ML para la afinidad y la especificidad. En particular, HLA-C*01:02 es un alelo prevalente que se encuentra en aproximadamente el 20% de las poblaciones de Asia oriental (aproximadamente el 10-15% en vietnamitas y otras poblaciones del sudeste asiático) y en aproximadamente el 12% de las poblaciones europeas, lo que respalda la amplia aplicabilidad clínica. Los ensayos in vitro y en esferoides 3D exhaustivos demostraron una citotoxicidad robusta y restringida por alelos contra tumores que expresan p53R273H endógeno, con efectos secundarios mínimos (Figura 1A). Al proporcionar un TCE específico para la mutación y de alta afinidad contra este neoantígeno prevalente y clínicamente desafiante, el presente estudio ofrece una prometedora estrategia terapéutica para un gran subconjunto de cánceres con mutaciones en p53 que actualmente no tienen opciones terapéuticas eficaces, y destaca la sinergia de la optimización estructural y computacional en el diseño de TCE dirigidos a neoantígenos.

Resultados

Caracterización y evaluación del TCR dirigido a p53 en el contexto de un receptor de unión a células T

En nuestro estudio anterior, en un intento de establecer un procedimiento para identificar un receptor de células T reactivo a un neoantígeno compartido, se recolectaron y procesaron muestras de pacientes diagnosticados con diversos cánceres.^[31] Entre ellas, una muestra correspondía a un cáncer colorrectal que presentaba una mutación puntual endógena en el gen TP53, lo que resultaba en la sustitución de la arginina en el codón 273 por histidina (R273H). Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de este paciente se expusieron a péptidos de 25 aminoácidos que correspondían a la región de p53 R273 que contenía residuos del tipo salvaje o R273H (SGNLLGRNSFEVRVCACPGRDRRTE o SGNLLGRNSFEVHVCACPGRDRRTE). Se utilizó el ensayo de ELISPOT para evaluar la reactividad de las células T.^[31] Las poblaciones de células T que exhibían un aumento de más de 2 veces cuando se exponían al péptido mutante se sometieron a aislamiento de células individuales y secuenciación de nueva generación (NGS). El análisis de la secuencia de esta muestra identificó un nuevo receptor de células T, designado TCR01 (que corresponde a TCR12.1 en la solicitud de patente 12442046).^[31] Dado que la selección de clones requirió un umbral funcional (>2 veces de aumento en la secreción de IFN-γ frente al péptido mutante), este enfoque enriquece las poblaciones de clones de células T con mayor afinidad relativa por su pHLA cognoscible en comparación con los repertorios no seleccionados o clasificados por tetrámeros, lo que es consistente con el fenómeno establecido de la maduración de la afinidad durante la selección clonal de células T impulsada por el antígeno. TCR01 se utilizó en su forma aislada de forma natural, sin una ingeniería de afinidad posterior. Además, la tipificación del HLA de clase I del paciente reveló los siguientes alelos: HLA-A*02:06, HLA-A*11:01, HLA-B*40:01, HLA-B*54:01, HLA-C*01:02 y HLA-C*07:02 (Figura 1B; Tabla S1). Estos datos sugieren colectivamente que p53R273H puede servir como un posible neoepítopo presentado por uno o más de los alelos HLA de clase I del paciente.^[31] En este estudio, la secuencia del TCR01 identificado se utilizó para diseñar un TCE dirigido a p53R273H. Aunque los estudios preliminares han propuesto TCR candidatos capaces de reconocer el neoepítopo p53R273H, en el momento de este estudio, solo se han publicado datos limitados sobre el tinte de pHLA/p53R273H con tetrámeros o sobre el propio TCR01, en particular en el contexto de su incorporación en el formato TCE. Para evaluar aún más el potencial terapéutico de este enfoque, primero caracterizamos la capacidad de presentación del epítopo p53 de los alelos HLA derivados del paciente, así como la eficacia del TCE basado en TCR01, al que nos referimos como la clase TCE01.

Anteriormente, establecimos una plataforma de receptores que activan las células T mediante la incorporación de TCR 1-2C, que se dirige a KRASG12V presentado por HLA-A∗11:01.^[22] Utilizando un enfoque similar, generamos TCE01A, en el que una cadena única de TCR01 (sTCR01) se fusiona al extremo N-terminal de un fragmento variable de cadena única anti-CD3 (sCD3), seguido de una cadena Fc de cadena única en formato de "knob-into-hole" [KIH]. Se utiliza la designación TCE01A para distinguirlo de otros formatos de TCE que utilizaremos más adelante en este estudio (Figura S1A). Además, modificamos genéticamente la línea celular de cáncer colorrectal SW620 para que exprese de forma estable los HLA relevantes identificados en la muestra del paciente. Existían dos versiones diferentes del mismo HLA introducido en el CRC SW620, incluyendo la secuencia original y la versión etiquetada con DYKDDDDK (FLAG)-6xHis-DYKDDDDK. Las etiquetas epítópicas se insertaron en el extremo C-terminal del dominio alfa 3 (α3) en la región extracelular, inmediatamente antes del extremo N-terminal del dominio transmembrana (TM). Este diseño asegura la correcta localización de membrana de los HLA modificados genéticamente (Figuras S1B y S1C).^[32] Para las células de cáncer de pulmón NCI-H520, las células de cáncer de páncreas PANC-1 y las células de cáncer de mama MDA-MB-468, se modificó genéticamente el HLA no etiquetado (Figura S1B).

Para evaluar la posible presentación del neoepítopo derivado de p53R273H por los alelos HLA de clase I del paciente, se cultivó la SW620 modificada genéticamente con un péptido largo de p53R273H de 25 aminoácidos (20 μM). La citotoxicidad dependiente de las células T se evaluó mediante el cocultivo con células T y TCE01A en un rango de concentración de 10−4 a 101 nM. A las 24 horas, se observó una citotoxicidad mediada por las células T superior para las células que presentaban el complejo HLA-C∗01:02/p53R273H, alcanzando hasta aproximadamente el 74,86% de lisis, en comparación con una lisis moderada para HLA-B∗54:01 y una lisis mínima o insignificante para HLA-A∗02:06, HLA-A∗11:01, HLA-B∗40:01, HLA-C∗07:02 y el control simulado (Figura 1C). La alta citotoxicidad observada en HLA-C∗01:02 fue independiente de la presencia o ausencia de etiquetas epítópicas utilizadas en nuestras construcciones (Figura S1D). Además, estas observaciones también resaltan la potencia alelo-específica del TCE dirigido a p53R273H en el reconocimiento de neoepítopos.

Aunque el péptido de 25 aminoácidos fue diseñado para abarcar los epítopos principales, su procesamiento intracelular y su carga en HLA-C∗01:02 son menos eficientes y más variables. En contraste, el pequeño péptido procesado de 8 a 11 aminoácidos puede unirse directamente a este HLA y dar como resultado una citotoxicidad mediada por las células T robusta. Por lo tanto, es necesario identificar el(los) péptido(s) específico(s) derivado(s) de p53 presentado(s) por HLA-C∗01:02. Para el cribado inicial, utilizamos NetHMCScan 4.1 para predecir y comparar la afinidad de unión de los péptidos derivados de p53R273H (8-14 aminoácidos) a HLA-C∗01:02, así como a otros alelos HLA derivados del paciente (Tablas S1). Seleccionamos los 5 principales candidatos de péptidos con el mayor potencial de presentación predicho para una evaluación adicional (Figuras 1D; Tablas S2 y S3). En nuestros experimentos, las células SW620 que expresan HLA-C∗01:02 y que fueron cultivadas con estos péptidos candidatos mostraron diferentes grados de eficiencia de lisis mediada por las células T. En particular, los péptidos de 9 aminoácidos H5 y H6 indujeron una citotoxicidad significativa, mientras que los otros tres candidatos no mostraron diferencias con el control simulado (Figura 1E). Es interesante destacar que las células que expresan HLA-C∗01:02 y que fueron cultivadas con el péptido de 9 aminoácidos H5 mostraron una citotoxicidad dependiente de las células T más robusta a una dosis de 0,25 y 0,0625 nM que las células cultivadas con el péptido de 25 aminoácidos en las mismas condiciones (Figura 1E).

Modificación genética de TCR01 en diferentes formatos de TCE

En el presente estudio, ampliamos aún más la plataforma TCE previa en términos de posiciones espaciales relativas entre la cadena única de TCR (sTCR) y la cadena única anti-CD3 (sCD3), al tiempo que buscamos equilibrar el tamaño molecular y la estabilidad. Los variantes de TCE se designan como TCE01XrN, donde X denota la arquitectura molecular (A-D; consulte la Figura 1F para los esquemas de dominio y los pesos moleculares) y rN indica la iteración de optimización en el andamio TCE01 (r1 = candidato principal de la primera ronda de modificación genética, r2 = candidato principal de la segunda ronda, r3 = candidato principal de la tercera ronda). Anteriormente, desarrollamos y validamos dos formatos de TCE dirigidos al neoepítopo KRASG12V presentado por HLA-A∗11:01, designados como A y B.^[22] El formato A se describió brevemente en la sección anterior, mientras que el formato B consiste en una cadena Fc KIH que se fusiona en el extremo N-terminal a sTCR y en el extremo C-terminal a sCD3. En ambos formatos, se incluyeron las regiones constantes de las cadenas alfa y beta del TCR para promover el emparejamiento correcto de las cadenas y mantener la similitud estructural con el TCR nativo.

En este estudio, buscamos reducir el tamaño molecular de nuestras moléculas TCE minimizando el contenido de dominio, al tiempo que preservamos la afinidad de unión y la funcionalidad del anticuerpo (Figura 1F). A pesar de las similitudes entre los anticuerpos y los TCR, que están compuestos por regiones variables y constantes, los dominios variables del TCR son intrínsecamente inestables y propensos a plegarse o agregarse incorrectamente sin sus dominios constantes, especialmente en el caso del TCE, donde también se eliminan las regiones transmembrana.^[30],^[33],^[34] En un estudio reciente, Boucher et al. demostraron que retener solo los dominios variables de un anticuerpo es factible introduciendo un residuo de cisteína en cada fragmento variable e incorporando un enlazador que imita la bisagra de la región Fc.^[26] Este enfoque dio como resultado el denominado fragmento variable de cadena única "engrapado" (spFv o scFv engrapado). Se ha utilizado un enfoque similar durante el desarrollo de ABBV-184, un TCE bispecífico dirigido a Survivin, diseñado por Chervin et al.; sin embargo, dicho formato solo se mencionó en su patente, pero no en la publicación principal.^[35] En general, en el momento de este estudio, se han informado un número limitado de aplicaciones de moléculas miniTCE.

En este estudio, adoptamos un enfoque similar al descrito por Boucher et al. para generar el TCE de cadena única "engrapado" que contiene TCR01. El residuo de metionina en la posición 43 de la cadena beta se sustituyó por cisteína (M43C), y el residuo de alanina 100 se sustituyó por cisteína (A100C) en la cadena alfa. Estos residuos se encuentran fuera de la región determinante de la complementariedad (CDR) en ambas cadenas y están posicionados para formar enlaces disulfuro con el enlazador tipo bisagra que conecta las dos cadenas. El enlazador consistió en dos copias del enlazador flexible G4S, seguido de una secuencia tipo bisagra CPPC y luego una copia adicional del enlazador G4S (Figura S1E). La distancia predicha entre los átomos de Cα de M42C y A100C fue de 4,0 Å, y la distancia predicha entre los dos residuos de cisteína en el enlazador fue de 6,8 Å (Figuras S1E y S1F). Estos valores se encuentran dentro del rango típico observado para las distancias Cα-Cα en la región de la bisagra del anticuerpo IgG estándar, que es de aproximadamente 5,0 a 7,0 Å. La implementación del enfoque de "engrapado" generó dos plataformas adicionales utilizadas en este estudio (Figura 1F). Esta estrategia redujo el peso molecular teórico del TCE01 de 130,38 kDa (en TCE01A y TCE01B) a aproximadamente 104,80 kDa (en TCE01C y TCE01D), lo que corresponde a una reducción del 24,40% (Figuras 1F y S1G).

Se utilizó interferometría de capa biológica (BLI) para evaluar la afinidad de unión de los variantes de TCE01 para el complejo pHLA-C∗01:02/p53R273H de 9 aminoácidos (H5). El pHLA-C∗01:02/p53R273H de 9 aminoácidos H5 se inmovilizó en el biosensor y la unión de los variantes de TCE01 se realizó en una dilución serial de 3 pliegues. Todos los variantes de TCE01 (A-D) mostraron afinidades de unión comparables al complejo pHLA-C∗01:02/p53R273H de 9 aminoácidos H5 inmovilizado, con valores de constante de disociación (Kd) de 17,43 nM (TCE01A), 18,58 nM (TCE01B), 20,22 nM (TCE01C) y 25,21 nM (TCE01D). Estos resultados indican que el formato "engrapado" preserva eficazmente la actividad de unión original (Figura 1G). Los valores de Kd obtenidos para los variantes de TCE01 (17-25 nM) son más altos que el rango de afinidad que se informa habitualmente para las interacciones TCR-pHLA naturales (1-100 μM). Esto es consistente con el aislamiento de TCR01 mediante un cribado basado en la avidez funcional en lugar del muestreo de repertorio convencional o clasificado por tetrámero (ver arriba). También observamos que, dado que el ligando pHLA se inmovilizó como un tetrámero basado en la estreptavidina, los valores de Kd informados pueden representar afinidades aparentes que pueden verse influenciadas por la avidez local/reunión en la superficie del sensor en lugar de reflejar estrictamente la afinidad monomérica 1:1 intrínseca.

A continuación, evaluamos las afinidades de unión a nivel celular de los constructos TCE a CD3 y a las células diana HLA-C∗01:02 que expresan p53R273H mediante citometría de flujo. Todos los TCE01A, TCE01B, TCE01C y TCE01D exhibieron una alta afinidad de unión a CD3ε en las células T con valores de Kd de 2,544 nM, 2,322 nM, 2,467 nM y 2,763 nM, respectivamente. Todos estos valores son más altos (menor afinidad) que el del anticuerpo parental anti-CD3 en 136,3 pM (Figura 1H).^[22] Coherente con los resultados de BLI, la unión de los variantes de TCE01 a las células SW620 que expresan HLA-C∗01:02 y que fueron cultivadas con el péptido p53R273H de 9 aminoácidos H5 no mostró diferencias significativas entre TCE01A-D con un Kd de 121,42 nM (TCE01A), 134,11 nM (TCE01B), 101,24 nM (TCE01C) y 112,52 nM (TCE01D) (Figuras 1I y 1J).

Vale la pena señalar las diferencias de rendimiento entre las versiones "engrapadas" (TCE01C y TCE01D) y las versiones no "engrapadas" (designadas con el signo ∗, por ejemplo, TCE01C∗ y TCE01D∗). En condiciones similares, observamos una reducción notable en la afinidad de unión con valores de Kd de 60,42 nM para TCE01C∗ (en comparación con 20,22 nM para TCE01C) y 78,73 nM para TCE01D∗ (en comparación con 25,21 nM en TCE01D) (Figura S1H). Además, los variantes de TCE no "engrapados" (TCE01C∗ y TCE01D∗) mostraron nuevamente una afinidad de unión más débil a las células SW620 que expresan HLA-C∗01:02 y que fueron cultivadas con el péptido p53R273H, en comparación con sus versiones "engrapadas" TCE01C y TCE01D, lo que es coherente con el enfoque BLI (Figura S1I). Para simplificar, a partir de ahora, nos centraremos únicamente en las versiones "engrapadas" con TCE01C y TCE01D. Estos datos demuestran que TCE01A-D conservan la unión bispecífica tanto al complejo pHLA-C∗01:02/p53R273H de 9 aminoácidos H5 a través del motivo TCR, como a CD3ε a través del motivo anti-CD3, y, lo que es importante, el enfoque de "engrapado" se puede utilizar como una opción potencial para reducir aún más el tamaño de la región TCR que se incorporará en los formatos TCE.

El TCE dirigido a p53R273H, TCE01, promueve la citotoxicidad mediada por las células T in vitro

Para investigar la capacidad de los variantes de TCE01 para activar las células T y mediar la muerte de las células diana, se cocultivaron las moléculas TCE con células SW620 de CRC que expresan HLA-C∗01:02 y que fueron cultivadas con el péptido p53R273H de 9 aminoácidos H5 y células T humanas primarias en un modo dependiente de la dosis. La viabilidad de las células diana se cuantificó a las 24 horas posteriores al cocultivo utilizando el ensayo de luminiscencia ATP de CellTiter-Glo. A pesar de las afinidades de unión comparables entre los variantes, TCE01A demostró una eficacia citotóxica reducida, con una lisis específica máxima del 72,24%. TCE01B alcanzó un 78,62% de citotoxicidad máxima, mientras que TCE01C y TCE01D indujeron una citotoxicidad más alta, con máximos del 92,52% y 95,26%, respectivamente (Figura 2A). Todos los cuatro variantes de TCE01 lograron una citotoxicidad casi máxima a una concentración ≥0,01 nM, con una lisis específica óptima observada a 0,625 nM y superior. La activación de las células T inducida por los variantes de TCE01 se evaluó además midiendo la expresión de CD69 mediante citometría de flujo. TCE01A y TCE01B produjeron frecuencias máximas de CD69+ del 62,14% y 70,22%, respectivamente, que fueron sustancialmente más bajas que las observadas para TCE01C (87,24%) y TCE01D (86,82%) en condiciones equivalentes. Este patrón se alineó con la tendencia observada en la citotoxicidad mediada por las células T (Figura 2B).

Además, analizamos la liberación de gránulos citolíticos de las células T activadas por TCE mediante citometría de flujo para cuantificar la perforina y la granzima B. La expresión de la granzima B aumentó en las muestras tratadas con TCE01, con frecuencias del 44,15 % para TCE01A, 62,51 % para TCE01B, 78,42 % para TCE01C y 71,22 % para TCE01D, lo que coincide con el perfil de activación de CD69 y el resultado de citotoxicidad mediada por células T (Figura 2C). De manera similar, la expresión de la perforina siguió una tendencia similar, aunque con frecuencias más bajas (40,05 % para TCE01A, 48,51 % para TCE01B, 62,21 % para TCE01C y 59,25 % para TCE01D) (Figura 2D). En línea con estos marcadores de activación y función citolítica, la secreción de interferón gamma (IFN-γ) exhibió un patrón dependiente de la dosis comparable entre las variantes de TCE01 (Figura 2E). En conjunto, la capacidad de las variantes de TCE01 para unirse, reclutar y activar las células T les permite promover eficazmente la citotoxicidad contra las células de CCRC que expresan pHLA-C∗01:02/p53R273H (Figura 2F).

Exploración de la sensibilidad de las variantes de TCE dirigidas a p53R273H en modelos 2D y 3D

Para investigar la sensibilidad de las variantes de TCE01, se co-incubaron células T humanas primarias con células diana a diversas relaciones E:T (0:1, 0,1:1, 0,5:1, 1:1, 2:1, 5:1 y 10:1), manteniendo constantes las concentraciones de TCE. Los datos mostraron que TCE01A y TCE01B alcanzaron una citotoxicidad óptima a partir de una relación E:T de 5:1, alcanzando el 68,52 % y el 76,24 %, respectivamente. En contraste, TCE01C y TCE01D indujeron una citotoxicidad significativa a una relación E:T de 2:1, con eficiencias de eliminación que superaron el 70 % y aumentaron aún más hasta aproximadamente el 92,56 % y el 94,52 %, respectivamente (Figura S2A). En los análisis de la serie temporal, TCE01C y TCE01D alcanzaron una eliminación casi completa de las células mediada por las células T a las 24 horas posteriores a la co-cultura, mientras que TCE01A y TCE01B requirieron hasta 48 horas para superar el 90 % de citotoxicidad (Figura S2B). En conjunto, estos hallazgos indican que los miniTCE (plataformas C y D) no solo reducen el peso molecular de las moléculas receptoras que se unen a las células T, sino que también mejoran sustancialmente su eficacia funcional. En consecuencia, los análisis posteriores priorizaron la variante TCE01C debido a su perfil superior en términos de peso molecular y potencia.

A continuación, examinamos la eficacia de TCE01C utilizando células T primarias derivadas de múltiples donantes sanos, reconociendo la importante variabilidad en los perfiles inmunitarios. Los pacientes exhiben diferentes respuestas a las mismas inmunoterapias, lo que destaca la importancia de evaluar la capacidad de TCE01C para reclutar y activar las células T de múltiples donantes.^[36] En siete donantes sanos, la CE50 de TCE01C para la citotoxicidad mediada por las células T osciló entre 0,62 pM (donante n.º 004, IC del 95 %: 0,58–0,68 pM) y 2862 pM (donante n.º 006; IC del 95 %, 1863–6183 pM), lo que representa un rango de aproximadamente 4600 veces (ANOVA de una vía sobre la CE50 transformada logarítmicamente, F6’14 = 490,3, p < 0,0001; prueba t de Welch para el donante n.º 004 frente al n.º 006, t = 25,5, df = 2,2, p = 0,001), lo que subraya la importante variabilidad interdonante en la respuesta de las células T (Figura 2G).

Para investigar más a fondo la potencia de TCE01C en modelos fisiológicamente relevantes, evaluamos su actividad en sistemas de esferoides 3D. Dada la creciente adopción de modelos 3D para la evaluación preclínica de la eficacia de los fármacos en el cáncer y otras enfermedades,^[37],^[38],^[39] generamos esferoides compuestos por células de CCRC que expresan HLA-C∗01:02 y que fueron pulsadas con el péptido p53 R273H, células madre derivadas de tejido adiposo humano (ASCs) y células endoteliales de cordón umbilical humano (HUVECs). Cabe destacar que solo las células de cáncer colorrectal dentro de los esferoides fueron diseñadas para expresar HLA-C∗01:02, mientras que todo el esferoide fue pulsado con el péptido de 9 aminoácidos p53 R273H (H5). Este diseño experimental recapitula parcialmente la heterogeneidad observada en las muestras tumorales derivadas de pacientes, en las que la expresión de HLA es variable entre los subconjuntos de células y no todas las células dentro del microambiente tumoral presentan el antígeno diana. Estos esferoides se co-cultivaron con células T primarias y TCE01C de forma dependiente de la dosis (Figura 2H). Los efectos terapéuticos se cuantificaron mediante ensayos basados en la fluorescencia y la secreción de IFN-γ. TCE01C eliminó el 82,45 % de las células de CCRC en 48 horas, acompañado de una liberación máxima de IFN-γ de 9,2 ng/mL, al tiempo que exhibía una citotoxicidad mínima o nula hacia las ASC y las HUVECs no malignas (Figuras 2I–2K). En conjunto, estos hallazgos destacan la sólida eficacia de TCE01C en diversas células T derivadas de pacientes y en complejos microambientes tumorales 3D.

Especificidad de TCE01C

Investigar la especificidad de los activadores de células T bispecíficos es fundamental para su desarrollo terapéutico exitoso. Para el TCE01C dirigido a p53R273H, la especificidad se evaluó en múltiples dimensiones: (1) especificidad del péptido, evaluada mediante el análisis de los residuos clave de interacción y los péptidos homólogos, (2) restricción de HLA, determinada mediante la comparación del reconocimiento de p53R273H presentado por diferentes alelos de HLA y (3) sensibilidad de TCE a los péptidos presentados específicamente por HLA-C∗01:02. Dado que el epítopo de 9 aminoácidos p53R273H H5 es presentado por HLA-C∗01:02, los péptidos estructuralmente similares también pueden ser presentados por esta molécula de HLA, lo que podría inducir cambios conformacionales que faciliten la unión de TCE y la citotoxicidad dependiente de las células T. Para explorar esta posibilidad, primero diseñamos y sintetizamos un panel de péptidos de 9 aminoácidos que contienen sustituciones en la posición del codón 273 de p53, análogos al epítopo de 9 aminoácidos p53R273H H5 utilizado aquí. Estos incluyeron variantes con asociaciones documentadas o predichas con la aparición y la progresión de diversos cánceres (Tablas S2 y S4), que abarcan R273H, R273C, R273L, R273G, R273P y R273S. Entre estas variantes de p53R273, TCE01C indujo la eliminación mediada por las células T de cuatro variantes: el diana primario R273H, así como R273C, R273L y, inesperadamente, R273 de tipo salvaje (R273WT). Los ensayos de unión en células corroboraron estos hallazgos, mostrando claros cambios de población que indican la unión de TCE01C con los mismos cuatro dianas (Figuras 3A y 3B). Además, titulamos los péptidos p53 R273H, R273WT y R273C de 0,002 a 20 000 nM. Las tres variantes alcanzaron una eficacia casi máxima a 2000 nM, siendo R273H el que exhibió una mayor potencia en comparación con los demás (Figura S2C). Estos resultados demostraron que TCE01C reconoce y se une funcionalmente a otras variantes de p53 R273 más allá del diana p53R273H previsto.^[1],^[40] Cabe destacar que, dado que la proteína p53 de tipo salvaje se somete a una degradación proteasómica continua y a una presentación en el MHC en las células normales, el reconocimiento observado del péptido p53 R273WT por TCE01C es particularmente preocupante, ya que demuestra la alta sensibilidad de la molécula hacia la secuencia de tipo salvaje. Además, examinamos posteriormente la actividad de TCE01C contra péptidos homólogos al péptido de 9 aminoácidos p53 R273H H5 (SFEVHVCAC) (Tabla S4). Se realizaron búsquedas de homología utilizando NCBI Blast y ExPAsy’s ScanProsite, permitiendo hasta siete desajustes como umbral.^[15],^[22],^[35],^[41],^[42] Cabe destacar que no se identificaron péptidos fuera del diana con un solo desajuste fuera de la posición R273 (quinto residuo en el nonámero). Entre estos dianas fuera del diana, TCE01C exhibió una actividad detectable únicamente contra el diana fuera del diana 01 (SFEIHVCSC) (Figura 3C).

La actividad observada de TCE01C hacia las variantes de R273, pero la respuesta limitada a los posibles dianas fuera del diana, sugiere posibles efectos fuera del diana que podrían atribuirse a (1) propiedades de unión intrínsecas de TCE, (2) residuos críticos de interacción de péptidos o (3) capacidad de presentación de HLA-C∗01:02. Para investigar esto, realizamos un escaneo de alanina generando variantes de alanina simple en cada posición (P1–P9) del péptido de 9 aminoácidos p53R273H H5 y evaluamos la actividad funcional de TCE01C en ensayos CellTiter-Glo (Tabla S4). De los ocho péptidos de alanina sustituidos, solo la variante V6A conservó la actividad total comparable al péptido original de 9 aminoácidos p53R273H H5. Las sustituciones S1A, H5A y C7A redujeron la eficacia de TCE01C en aproximadamente un 50 %, mientras que las sustituciones E3A y C9A causaron una reducción sustancial. Cabe destacar que las sustituciones de alanina en las posiciones F2A o V4A abolieron por completo la actividad funcional de TCE01C (Figura 3D). Dado que TCE01C también reconoció el péptido de 9 aminoácidos p53 R273H H6 con una eficacia moderada (Figura 1E), extendimos el escaneo de alanina a cada posición de este péptido (Tabla S4). Se observó una abolición completa en las sustituciones S2A, E4A y C8A, mientras que N1A y V5A indujeron una reducción parcial de la eficacia, lo que refleja los patrones en las variantes de alanina del péptido de 9 aminoácidos p53 R273H H5. Por el contrario, las sustituciones F3A, H6A y V7A no afectaron la función de TCE01C (Figura 3E). En conjunto, estos datos indican que los residuos segundo, cuarto y octavo en el péptido de 9 aminoácidos p53 R273H son fundamentales para la presentación de HLA-C∗01:02 y la eficacia de unión de TCE01C.

Para dilucidar la base estructural de las interacciones de TCE01C, empleamos enfoques de modelado computacional de última generación, específicamente Boltz-2 y AlphaFold 3, para predecir el complejo ternario que comprende TCE01C, HLA-C∗01:02 con el péptido de 9 aminoácidos p53R273H H5, el péptido de 9 aminoácidos p53R273H H6 o el péptido de 10 aminoácidos p53R273H H9.^[43],^[44] Se generaron estos modelos para identificar los residuos críticos para el complejo. De acuerdo con nuestros hallazgos in vitro, se predijo que los residuos segundo y octavo son esenciales para la presentación estable de los péptidos de 9 aminoácidos H5 y H6, mientras que el residuo segundo del péptido de 10 aminoácidos H9 exhibió inestabilidad dentro del complejo ternario. Además, también se predijo que el cuarto residuo en el péptido de 9 aminoácidos H5 contribuye a la estabilización del complejo, de modo que la sustitución de alanina en esta posición afectó notablemente tanto la presentación del péptido como la eficacia de unión de TCE01C (Figuras S2D–S2F). En estos modelos, surgió un patrón congruente con respecto a los factores clave que rigen la integridad del complejo.

Optimización computacional de TCE dirigido a p53R273H

La reactividad cruzada observada de TCE01C hacia las variantes de R273, junto con las respuestas limitadas a los posibles dianas fuera del diana, sugiere su posible utilidad para dirigirse a otras variantes de p53 R273 en diversos tipos de cáncer, especialmente dado que R273 es una mutación frecuente en las neoplasias humanas. Un TCE capaz de reconocer múltiples variantes podría funcionar como una terapia de uso general, aplicable a una cohorte de pacientes más amplia que abarca diversas indicaciones tumorales. La evidencia de respaldo demuestra que las moléculas de TCE que se unen a múltiples antígenos o variantes asociadas con tumores confieren un mejor reconocimiento tumoral y una mayor eficacia antitumoral en relación con aquellas con una especificidad de diana única estricta.^[45] Sin embargo, esta especificidad ampliada aumenta el riesgo de reactividad cruzada con el p53 de tipo salvaje u otros auto-péptidos no relacionados, que pueden surgir de forma estocástica en una población de pacientes heterogénea en función de las condiciones individuales.^[46],^[47] Aunque la proteína p53 mutada R273H generalmente está ausente en las células normales, el reconocimiento inadvertido del péptido p53 de tipo salvaje podría desencadenar una grave autoinmunidad sistémica o toxicidad en el diana/fuera del diana.^[5],^[48],^[49] Además, los TCR que pueden dirigirse a varias variantes pueden exhibir una afinidad disminuida por los dianas individuales, lo que limita la activación de las células T y la potencia tumoricida. Para abordar este posible compromiso entre la amplitud y la potencia, continuamos optimizando nuestra plataforma de TCE, priorizando las mejoras en el dominio TCR en el contexto de la arquitectura de TCE.

Inicialmente, predijimos la estructura del complejo pHLA-C∗01:02/p53R273H 9-mer H5, utilizando tres programas de modelado computacional independientes: AlphaFold 3, Boltz-2 y TCRmodel2.^[43],^[44],^[50] Si bien AlphaFold3 y Boltz-2 son modelos más generalistas, Boltz-2 es de código abierto, rápido y controlable, mientras que Alphafold3 proporciona la mayor precisión general. Se generaron varios modelos en paralelo utilizando estos dos programas y se clasificaron según la puntuación ipTM. Por otro lado, TCRmodel2 se entrenó basándose en una base de datos de acoplamiento de TCR y se utilizó en este enfoque para la validación cruzada. La mejor estructura de pHLA se utilizará para predecir la estructura del complejo con la adición de TCE01C utilizando los modelos mencionados anteriormente. Aprovechando esta estructura, realizamos una evolución dirigida guiada por aprendizaje automático utilizando tres herramientas complementarias de diseño de proteínas computacionales: EvoPro, EvoProtGrad y Antibody Evol^[27],^[51],^[52],^[53] (Figura 4A). Los candidatos emergentes se evaluaron para (1) afinidad de unión predicha (ddG, Prodigy y BoltzGen), (2) estabilidad estructural (DeepSP y Aggrescan 3D), (3) inmunogenicidad (ABImmpred y Hu-mAb) y (4) toxicidad (TAP).^[44],^[54],^[55],^[56],^[57] Entre estos criterios, la afinidad de unión se utilizó para clasificar los mejores candidatos, mientras que los siguientes, incluida la estabilidad y la inmunogenicidad, se incluyeron para predecir la seguridad y la eficacia de los candidatos generados. El candidato con la puntuación más alta de cada iteración sirvió como secuencia parental para las rondas posteriores de evolución dirigida, con los residuos optimizados fijados posteriormente. Este flujo de trabajo iterativo se completó después de tres ciclos de evolución dirigida computacional (Figuras 4A y S3A; Tabla S5). Cabe destacar que las modificaciones evolutivas no se limitaron a las CDR, ya que la evidencia acumulada subraya las contribuciones de los dominios no CDR a la dinámica conformacional, la afinidad de unión, la estabilidad de la interfaz y la eficacia funcional general en anticuerpos y moléculas relacionadas.^[58],^[59],^[60],^[61] El modelado del complejo ternario TCE01C/pHLA-C∗01:02/p53R273H 9-mer H5 reveló una interacción asimétrica restringida a un lado del surco de unión péptido-HLA, junto con un posicionamiento desproporcionado de las cadenas α/β, con la cadena α orientada (Figuras 4B y S3B). Investigaciones previas han establecido el papel fundamental de CDR3β en la funcionalidad del TCR. Los candidatos optimizados por aprendizaje automático exhibieron refinamientos conformacionales progresivos, facilitando una interacción integral a través del surco de unión del péptido y una alineación equitativa de ambas cadenas TCR hacia el epítopo (Figuras S3C–S3E). Los mejorados efectores mostraron una mayor eficacia de unión en las células diana para pHLA-C∗01:02/p53R273H 9-mer H5.

Uno de los desafíos actuales en el desarrollo de nuevas proteínas mediante programación computacional es confirmar si el rendimiento previsto de las nuevas variantes in silico se traduce fielmente en la realidad experimental tanto en modelos 2D como 3D. Para mitigar este riesgo y superar la brecha in silico-in vitro, los mejores candidatos de cada ronda evolutiva de evolución dirigida se sometieron a una validación empírica en ensayos basados en células antes de su avance. Los candidatos se evaluaron para la eficiencia de unión y la citotoxicidad dependiente de las células T. BLI reveló mejoras progresivas en la afinidad del TCR para el complejo estabilizado pHLA-C∗01:02/p53R273H 9-mer H5, con valores de Kd que disminuyeron de 20,22 nM (TCE01C) a 12,51 nM (TCE01Cr1), 3,12 nM (TCE01Cr2) y para la variante principal final, 2,51 nM (TCE01Cr3) (Figura 4C). Este aumento en la afinidad de unión in vitro se alinea estrechamente con la correspondiente disminución de los valores de Kd predichos obtenidos de las evaluaciones in silico en las rondas de optimización (Tabla S5). Los ensayos de unión en células confirmaron aún más estas mejoras, demostrando afinidades progresivamente mejoradas para el complejo diana pHLA-C∗01:02/p53R273H en las variantes sucesivas. El candidato principal final, TCE01Cr3, exhibió la señal de unión en células más fuerte, consistente con su perfil biofísico superior (Figuras 4C–4E).

Para comparar las potencias funcionales de las variantes de TCE optimizadas dirigidas a p53R273H, cuantificamos la citotoxicidad mediada por células T y la liberación de citocinas en cocultivos con SW620 que expresan HLA-C∗01:02 y que fueron pulsadas con el péptido p53R273H 9-mer H5. Las curvas de respuesta a la dosis para la lisis específica revelaron perfiles sigmoideos para todos los constructos de TCE, con una lisis máxima que se acercaba al 100% a concentraciones más altas. La variante optimizada principal, TCE01Cr3 (naranja), exhibió la mayor potencia (EC50 ≈ 10–5 nM), seguida de TCE01Cr2 (azul; EC50 ≈ 2 × 10−5 nM), TCE01Cr1 (verde; EC^[44] ≈ 6 × 10−4 nM) y el TCE01C parental (rojo; EC50 ≈ 5 × 10−3 nM). Las condiciones de control (TCR-Fc, CD3-Fc y células solamente) mostraron una actividad insignificante (Figura 5A). De manera similar, la secreción de IFN-γ siguió tendencias análogas, con TCE01Cr3 logrando la máxima liberación (∼7,85 ng/mL; EC50 ≈ 5 × 10−4 nM), superando a TCE01Cr2 (EC50 ≈ 10–3 nM), TCE01Cr1 (EC50 ≈ 5 × 10−3 nM) y TCE01C (EC50 ≈ 10–2 nM), mientras que los controles permanecieron en la línea de base (Figura 5B). A continuación, evaluamos la dependencia del efecto citotóxico mediado por TCE en las relaciones efector-diana (0:1, 0,1:1, 0,5:1, 1:1, 2:1, 5:1 y 10:1). Las cuatro variantes, TCE01C, TCE01Cr1, TCE01Cr2 y TCE01Cr3, indujeron una fuerte lisis de las células diana incluso a bajas relaciones E:T (tan bajas como 1:1), con una lisis máxima superior al 85% alcanzada a relaciones E:T de 5:1 y 10:1. A una relación E:T de 1:1, TCE01Cr2 y TCE01Cr3 lograron una citotoxicidad significativamente mayor que TCE01C y TCE01Cr1 (ANOVA de una vía, F3’8 = 56,5, p < 0,001), con diferencias por pares que oscilaron entre 1,8 veces (TCE01Cr2 vs. TCE01C, p ajustada de Tukey = 0,0007) y 2,8 veces (TCE01Cr3 vs. TCE01Cr1, p ajustada de Tukey < 0,001). A una relación E:T de 2:1, se observó el mismo orden de clasificación, pero las diferencias fueron menores y solo parcialmente significativas (F3’8 = 7,5, p = 0,010 en general). Solo TCE01Cr3 vs. TCE01Cr1 siguió siendo significativo después de la corrección (1,4 veces, p = 0,007), mientras que TCE01Cr2 vs. TCE01C no (1,06 veces, p = 0,85) (Figura 5C). Integrando las predicciones computacionales, los datos de unión biofísica y los datos celulares preliminares, TCE01Cr3 surgió como el candidato principal para una evaluación avanzada. Posteriormente, las evaluaciones se centraron principalmente en TCE01Cr3, incorporando variantes complementarias cuando fue pertinente. TCE01Cr3 demostró una mayor fidelidad en el tetrámero HLA-C∗01:02/p53R273H 9-mer H5.

De manera similar al TCE01C parental, fue imprescindible realizar un perfil de especificidad integral del TCE01Cr3 optimizado por aprendizaje automático. Los ensayos de cocultivo demostraron una robusta lisis mediada por células T de las células diana que presentaban el neoantígeno p53R273H, con una lisis específica máxima que superaba el 80%. Todavía se detectó una citotoxicidad residual contra las células pulsadas con los péptidos R273C y R273 de tipo salvaje, aunque la magnitud de la lisis se redujo sustancialmente en comparación con el TCE01C parental (Figura 3A). En contraste, no se detectó ninguna respuesta medible contra las células pulsadas con R273L, R273G, R273P, R273S o controles sin péptido (Figura 5D). TCE01Cr3 exhibió una fuerte unión a las células SW620 pulsadas con el péptido p53 R273H 9-mer, una unión moderada a los péptidos R273C y R273 de tipo salvaje, y ninguna unión detectable a los péptidos R273L, R273G, R273P, R273S o controles sin péptido (Figura 5E). Cabe mencionar que, en este enfoque, los péptidos que contienen estas variantes de p53 R273 se pulsaron a una dosis de 20 μM, que se encuentra entre las dosis más altas de péptido que se utilizan en estudios similares^[23],^[39],^[62] y que superan con creces la capacidad de presentación nativa del neoantígeno. Para el p53 R273 9-mer que contiene R273H, R273WT o R273C, que desencadenaron la citotoxicidad mediada por TCE de TCE01Cr3, se evaluó la sensibilidad en un rango de dosis de péptido de 20.000 a 0,002 nM. La lisis específica alcanzó un máximo de aproximadamente 88–90% a concentraciones más altas de péptido R273H a partir de 2 a 20.000 nM, con una EC50 en el rango nanomolar. En contraste, tanto el péptido mutante R273WT como el R273C solo desencadenaron la muerte mediada por TCE a una dosis de 20.000 nM de péptido y se redujeron drásticamente a dosis más bajas (Figura 5F). La pulsación con el péptido R273WT de tipo salvaje resultó en una lisis insignificante en todo el rango de concentración. El mutante relacionado R273C indujo solo una lisis mínima a las concentraciones más altas probadas, lo que confirmó una fuerte discriminación contra la secuencia de tipo salvaje y esta variante de un solo aminoácido.

Las evaluaciones fuera del objetivo produjeron una lisis robusta (>80% de máximo) exclusivamente para el objetivo R273H, con una actividad insignificante contra homólogos o controles (Figura 5G). Los ensayos de restricción alélica confirmaron una lisis potente y específica exclusivamente para HLA-C∗01:02 pulsado con el péptido p53R273H 9-mer H5, con respuestas insignificantes a HLA-A∗02:06, HLA-A∗11:01, HLA-B∗40:01, HLA-B∗54:01, HLA-C∗07:02 o controles (Figura 5H). Estos resultados confirman la exquisita especificidad alélica y de péptido de TCE01Cr3 para el complejo HLA-C∗01:02–p53R273H.

De manera similar, el barrido de alanina del epítopo H5 de 9 aminoácidos del núcleo p53R273H (SFEVHVCAC) identificó los residuos F2, E3, V4, H5, V6 y C7 como críticos, y las sustituciones provocaron reducciones marcadas o la abolición de la lisis, mientras que S1A y C9A aún exhibieron una débil citotoxicidad (Figura 5I). El mapeo in silico del complejo ternario de TCE, B2M/HLA-C∗01:02 y p53R273H de 9 aminoácidos H5 destacó la participación predominante de las CDR, con CDRβ1, CDRβ2 y CDRα3 favoreciendo los contactos con HLA-C∗01:02, y CDR3α/β involucradas tanto en la interacción con HLA como con el péptido, similar a estudios previos sobre otras interacciones TCR/HLA/péptido.^[22],^[35],^[63] La optimización computacional amplificó notablemente la unión de CDR3 con los residuos del péptido presentado, de forma concurrente con una interacción aumentada con HLA-C∗01:02 (Figura S3B; Tabla S6). Por otro lado, si bien el barrido de alanina en el péptido presentado nos permite identificar rápidamente los residuos críticos en los puntos calientes donde las interacciones de la cadena lateral pueden contribuir significativamente a la afinidad o especificidad de la unión, investigamos más a fondo el perfil de especificidad completo, particularmente para los residuos clave esenciales para anclar el péptido p53 R273H de 9 aminoácidos en HLA-C∗01:02 o los residuos involucrados en la interacción con el TCR, a saber, las posiciones 2, 5, 6 y 8 (P2, P5, P6 y P8). Los estudios estructurales de otros complejos HLA/TCR han sugerido un patrón en el que P2 y P8 son esenciales para la presentación adecuada del péptido en HLA, mientras que P5 y P6 están más involucrados en la interacción con el TCR.^[62],^[64],^[65],^[66] Este enfoque es necesario, especialmente en el caso del péptido p53 R273H de 9 aminoácidos H5 en este estudio, ya que la posición P8 es el residuo de alanina (SFEVHVCAC), que no se puede examinar más a partir de la perspectiva del barrido de alanina. Se generó una biblioteca de péptidos combinatorios donde cada uno de los residuos en la posición 2, 5, 6 y 8, correspondientes a F2, H5, V6 y A8, respectivamente, se sustituyó con 20 aminoácidos (Figura 6A). Se probaron las respuestas de TCE01C y TCE01Cr3 con las células diana mediante el ensayo de citotoxicidad CellTiter-Glo 2D. Para la posición #2, observamos una alta tolerancia de TCE01C para los aminoácidos hidrofóbicos, especialmente para aquellos con una cadena lateral aromática similar al residuo original, fenilalanina (F) (Figura 6B). La versión optimizada, TCE01Cr3, exhibió una reducción sustancial en la tolerancia; sin embargo, aún tiene cierta actividad fuera del objetivo detectable si esta posición se cambia a la categoría hidrofóbica, aunque en un nivel más bajo (Figura 6B). Para la posición #5, TCE01C mostró algunos niveles de tolerancia hacia los aminoácidos hidrofóbicos, especialmente para los residuos con carga negativa además de algunos hidrofóbicos como alanina (A) o leucina (L). TCE01Cr3 optimizado fue, en general, más sensible a la sustitución en esta posición, con baja a moderada actividad para los residuos hidrofílicos como C5, N5 y K5 (Figura 6C). La posición #6 mostró un problema importante de actividad fuera del objetivo para TCE01C si se sustituía por la categoría hidrofóbica, especialmente para el grupo alifático. Este problema se resolvió por completo en TCE01Cr3 cuando solo fue sensible a la valina en la sexta posición. Se observó reactividad cruzada en el anclaje C-terminal teórico A8 contra la sustitución con otros aminoácidos que también pertenecen a la familia hidrofóbica, además de los hidrofílicos T8 y Q8 para TCE01C. Por otro lado, TCE01Cr3 muestra una fidelidad más estricta en esta posición, con solo la alanina mostrando una citotoxicidad robusta (Figura 6E).

Luego, intentamos utilizar ScanProsite para analizar péptidos homólogos que cumplan con los motivos responsivos de TCE01Cr3 observados a partir del análisis de la biblioteca combinatoria de péptidos anterior. Este análisis da como resultado cuatro péptidos homólogos adicionales (Uniprot: A0R2I7, SAEVHVVTC; Uniprot: A3QFJ5, SSEVKVCAD; Uniprot: E1BBQ2, SEEVHVCLP; y Uniprot: P34388, IPEVHVCAV). Estos cuatro péptidos homólogos adicionales tienen de 3 a 4 desajustes en comparación con el péptido p53 R273H de 9 aminoácidos H5 que utilizamos a lo largo de este estudio. Sin embargo, ninguno de ellos proviene del genoma humano (Tabla S4). Además, también se investigó la sensibilidad contra los péptidos presentados por HLA-C∗01:02. La interacción con HLA-C∗01:02 anclará las regiones del TCR de TCE01Cr3 en las posiciones donde están expuestas a los péptidos presentados por este HLA, y por lo tanto, puede desencadenar una posible actividad fuera del objetivo. Como resultado, la evaluación de los péptidos presentados por este HLA puede proporcionarnos otra información sobre la especificidad de TCE01Cr3. Utilizando la Base de datos y herramientas de epítopos inmunitarios (IEDB), encontramos 2924 péptidos que se informó que son presentados por HLA-C∗01:02. Basándonos en el patrón de actividad fuera del objetivo al realizar el barrido de 20 aminoácidos para TCE01Cr3 en el péptido p53 R273H de 9 aminoácidos, seleccionamos los 10 candidatos principales para evaluaciones rápidas (Tabla S4, actividad fuera del objetivo 17-26). Estos candidatos tienen todos fenilalanina en la segunda posición (P2), lo que coincide con el péptido p53 R273H de 9 aminoácidos y puede servir como un importante punto de anclaje para la presentación del péptido. Además, también tienen coincidencias en la quinta (actividad fuera del objetivo 18), sexta (actividad fuera del objetivo 17-24) o octava (actividad fuera del objetivo 17, 25, 26) posiciones, lo que los hace más vulnerables al reconocimiento de TCE01Cr3. Se realizó un ensayo de citotoxicidad dependiente de las células T para estos candidatos en comparación con el péptido p53 R273H de 9 aminoácidos H5. En nuestros experimentos, estos 10 candidatos no desencadenaron una actividad significativa fuera del objetivo de TCE01Cr3, con la excepción de la actividad fuera del objetivo 17, que también tiene los residuos F2, V6 y A8, similares al péptido p53 R273H de 9 aminoácidos (Figura 6F).

Luego, examinamos más a fondo la eficacia de TCE01Cr3 contra la expresión endógena de p53R273H utilizando la línea de cáncer colorrectal SW620, que alberga la mutación heterocigota p53R273H.^[54] Los ensayos de citotoxicidad iniciales que utilizan células SW620 diseñadas para expresar HLA-C∗01:02 y que fueron pulsadas con el péptido p53 R273H revelaron una lisis específica de referencia del 15-20% incluso a bajas dosis de las variantes optimizadas (TCE01Cr1, TCE01Cr2 y TCE01Cr3), mientras que el TCE01C parental no mostró actividad detectable en las mismas condiciones (Figura 5A), lo que llevó a un escrutinio de la hipersensibilidad o la reactividad cruzada. Si bien la reactividad cruzada de TCE01Cr3 se investigó parcialmente a través del cribado de actividad fuera del objetivo, el barrido de alanina y el cribado de péptidos combinatorios en los residuos esenciales (Figuras 5D-5I y 6A-6E), aún se desconoce si TCE01Cr3 es hipersensible, especialmente a p53 R273H endógeno, ya que la línea celular SW620 utilizada a lo largo de este estudio es heterocigota para TP53 R273H. Para determinar si la heterocigosidad contribuyó a esta sensibilidad, se utilizó CRISPR/Cas9 para editar el exón 8 de p53 que flanquea R273 con dos ARNg y una plantilla de reparación que codifica la modificación 818819GT > AC (Figura S4A). Las células transfectadas con el plásmido que expresa Cas9 y ARNg se aislaron para su posterior evaluación (Figura S4B). Entre estas células, se observó la edición en aproximadamente el 12,27% de la población (Figura S4C). Las derivadas clonales se verificaron mediante PCR específica de variantes y expresión de p21 (indicativo de la ablación del p53 de tipo salvaje) (Figuras S4D-S4F). Las líneas resultantes incluyeron p53 de tipo salvaje homocigoto y p53 R273H heterocigoto (818G > A nativo más CRISPR 818819GT > AC). Las modificaciones se verificaron mediante secuenciación de Sanger, seguida de NGS que confirmó la modificación en el objetivo y ediciones fuera del objetivo insignificantes (Figuras S4G y S4H). En particular, los clones de p53 R273H homocigotos (818G > A o 818_819GT > AC) resultaron inviables para el cultivo sostenido (datos no mostrados), mientras que se obtuvo la línea celular heterocigota con dos alelos mutados diferentes que codifican el mismo p53 R273H. Como resultado, en los experimentos relacionados, utilizamos esta línea celular en paralelo con las líneas celulares p53R273WT homocigotas y p53R273H heterocigotas. En estos modelos endógenos, TCE01Cr3 logró un 47,81% de citotoxicidad a 3,9 × 10−2 nM en las células p53R273H heterocigotas en comparación con el 26,44% en los heterocigotos. En comparación, TCE01C produjo un 26,82% y un 23,56%, respectivamente, a 4,0 nM. No se observó una muerte significativa en SW620 que expresara HLA-C∗01:02 y que albergara p53R273H de tipo salvaje homocigoto, así como en SW620 que expresara HLA-A∗11:01 (Figura 6G).

Además, evaluamos más a fondo la potencia de TCE01Cr3 en un panel de líneas celulares, incluidas las líneas de células cancerosas SW620 (carcinoma colorrectal), NCI-H520 (cáncer de pulmón), MDA-MB-468 (carcinoma de mama) y PANC-1 (cáncer de páncreas), así como las líneas no cancerosas HEK293 (riñón embrionario humano) y CCL-75 WI-38 (fibroblastos pulmonares humanos). SW620 es heterocigoto para TP53 R273H, MDA-MB-468 y PANC-1 son homocigotos para TP53 R273H, mientras que NCI-H520 es homocigoto de tipo salvaje en este locus, similar a las células no malignas. Las células diana con el péptido p53 R273H endógeno se cocultivaron con TCE01Cr3 y células T a una relación E:T de 10:1 y se evaluó la viabilidad a 0, 24, 48 y 72 h. Observamos una citotoxicidad mediada por células T significativa en las tres líneas de células cancerosas, aunque con diferente eficiencia. La mayor muerte se observó en las células MDA-MB-468 y PANC-1 que expresan HLA-C∗01:02 a las 48-72 h, seguida de SW620 en condiciones similares. En contraste, no se detectó una citotoxicidad significativa en las líneas de células cancerosas que carecían de HLA-C∗01:02 ni en las líneas celulares no cancerosas HEK293 o WI-38 (Figura 6H).

Evaluación de la estabilidad de TCE dirigido a HLA-C∗01:02/p53 R273H

Investigamos más a fondo la estabilidad de TCE01Cr3. TCE01Cr3 emplea una arquitectura de cadena única (mínima) truncada, en la que se omiten los dominios constantes del TCR, lo que puede influir no solo en la funcionalidad sino también en la estabilidad. Dado que el enfoque de cadena única estabilizada es emergente en el campo, esta característica se consideró cuidadosamente en nuestros diseños.^[26] Estudios independientes han sugerido que el dominio Fc puede extender la vida media de las moléculas de acoplamiento de células T bispecíficas.^[22],^[35],^[63] Para determinar si este perfil de estabilidad era específico de la línea derivada de TCE01C o generalizable en los formatos, cada una de las cuatro arquitecturas utilizadas en este estudio se administró por vía intravenosa a ratones suizos y se evaluó la estabilidad midiendo las concentraciones séricas residuales durante 72 h mediante ELISA, con la vida media derivada mediante análisis no compartimental (Phoenix WinNonlin 8.5.2.4, Modelo 201) a partir de la fase de eliminación log-lineal terminal del perfil de concentración-tiempo de cada animal. Específicamente, TCE01Ar3 (plataforma A) y TCE01Br3 (plataforma B) conservan tanto las regiones variables como las constantes del TCR, mientras que TCE01Cr3 (plataforma C) y TCE01Dr.3 (plataforma D) emplean la arquitectura de cadena única truncada y estabilizada. Se compararon las concentraciones séricas de los cuatro formatos durante el mismo período de tiempo.

Nuestros resultados mostraron que TCE01Cr3 tenía una vida media de 39,40 ± 10,50 h (Figura 7A; Tabla 1). Para determinar si la modificación de estabilización en sí misma afecta la estabilidad sistémica, comparamos TCE01Cr3 con los otros tres formatos y observamos vidas medias comparables en los cuatro (TCE01Ar3: 43,72 ± 10,71 h, N = 4; TCE01Br3: 48,12 ± 24,62 h, N = 6; TCE01Dr.3: 30,85 ± 16,36 h, N = 6) (Figuras 7A; Tabla S1), sin evidencia de que los formatos estabilizados (TCE01Cr3 y TCE01Dr.3) se eliminaran más rápido que sus contrapartes no estabilizadas (TCE01Ar3 y TCE01Br3). Estos datos indican que, dentro de este conjunto de formatos optimizados, la estrategia de estabilización no comprometió la estabilidad sistémica.

Para investigar más a fondo la estabilidad sérica de estos formatos in vitro, cada molécula se pre-incubó en suero humano a 37 °C durante 0-128 horas. Tras la pre-incubación, las muestras se cocultivaron con células T primarias y células diana que expresan HLA-C\*01:02, y que fueron pulsadas con el péptido p53 R273H, durante 24 horas adicionales, y la estabilidad se evaluó indirectamente mediante la medición de la liberación de IFN-γ como un indicador funcional. La pre-incubación prolongada condujo a una menor liberación de IFN-γ, particularmente en las muestras pre-incubadas durante más de 16 horas.^[22] Para evaluar con precisión cómo los cambios en la estabilidad del TCE en suero afectan a la funcionalidad posterior, los niveles de IFN-γ se normalizaron con respecto a los valores obtenidos de las muestras de pre-incubación correspondientes a 0 horas (definidas como 100% de actividad), con controles tratados con placebo establecidos en 0%. La actividad de TCE01Cr3 disminuyó en aproximadamente un 15% durante la primera hora, seguida de una reducción adicional hasta una pérdida del 20-40% en 2-4 horas y aproximadamente un 30% de pérdida en 8 horas. Con una incubación prolongada, la tasa de disminución se redujo considerablemente, estabilizándose a las 128 horas con un 20,43% de actividad residual. Los otros tres formatos mostraron un patrón de disminución general comparable durante el mismo período de tiempo (Figura 7B). Estos resultados indican que la estrategia de "stapling" tuvo solo un impacto mínimo en la estabilidad sérica a largo plazo de TCE01Cr3, lo que es consistente con el perfil comparable de los cuatro formatos observado en la Figura 7A.### El TCE01Cr3 derivado de ML requiere un refinamiento estructural tanto en las regiones CDR como no CDR

Aunque el mapeo in silico del complejo ternario de TCE01Cr3, B2M/HLA-C\*01:02 y p53R273H 9-mer H5 destacó la participación predominante de las CDR, no tuvo en cuenta las contribuciones al plegamiento conformacional, como lo evidencian las distintas orientaciones espaciales entre TCE01C y TCE01Cr3 en relación con B2M/HLA-C\*01:02/p53R273H 9-mer H5 (Figuras S3B-S3E; Tabla S6). Además, para los candidatos optimizados, también notamos algunas mutaciones fuera de las regiones CDR y nos preguntamos cuánto contribuyen estos reemplazos a la actividad de las versiones optimizadas (Figura 4B). Para determinar si las modificaciones no CDR son esenciales para la unión y la funcionalidad de los TCE dirigidos a p53, generamos variantes híbridas intercambiando las regiones CDR y no CDR entre TCE01C y TCE01Cr3. Específicamente, el marco no CDR de TCE01Cr3 se integró en TCE01C para obtener TCE01C-S, mientras que el marco no CDR de TCE01C se integró en TCE01Cr3 para obtener TCE01Cr3-S (Figura S5A). La predicción in silico de la estructura 3D reveló una mayor similitud entre TCE01C-S y TCE01Cr3, y entre TCE01C y TCE01Cr3-S (Figuras S5B-S5E). Además, los análisis de respuesta dosis de la muerte celular y los ensayos de liberación de IFN-γ demostraron una eficacia reducida para TCE01C-S y TCE01Cr3-S en relación con la eficacia de TCE01Cr3, aunque ambos híbridos superaron a TCE01C (Figuras S5F y S5G). En particular, la eliminación de las regiones no CDR del TCR de TCE01Cr3 disminuyó notablemente la actividad citotóxica, mientras que el injerto de estas regiones no CDR en TCE01C-S mejoró sustancialmente su potencia. Por otro lado, la especificidad se evaluó mediante el cocultivo con SW620 que expresaba HLA-C\*01:02 y que fue pulsada con el péptido p53R273C 9-mer C5, y TCE01C-S y TCE01Cr3-S mostraron un nivel intermedio de actividad fuera del objetivo (Figura S5H). Estos hallazgos en conjunto indican que las optimizaciones limitadas a las CDR o a las regiones no CDR son insuficientes para mejorar completamente la actividad y la especificidad de los TCE derivados de ML, lo que requiere modificaciones coordinadas en ambas regiones.

En particular, dado que TCE01C es sensible a HLA-C\*01:02/p53R273C 9-mer C5, aplicamos un enfoque y criterios análogos a los dirigidos por ML para desarrollar TCE04C con una sensibilidad y especificidad mejoradas para este objetivo (Figura S5I). TCE04C exhibió una mayor citotoxicidad y especificidad hacia HLA-C\*01:02/p53R273C (Figuras S5J y S5K), lo que justifica una mayor investigación en estudios posteriores.### Las variantes optimizadas de TCE inducen una potente citotoxicidad mediada por células T en esferoides tumorales multicelulares 3D

Para evaluar la eficacia antitumoral de las variantes optimizadas de TCE en entornos de tumores 3D complejos, se ensamblaron esferoides multicelulares que comprendían células de CRC que expresaban HLA-C\*01:02 y que fueron pulsadas con p53R273H 9-mer H5 (fluorescencia verde), células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs; rojo) y células madre derivadas del tejido adiposo (ASCs; azul). Los esferoides se trataron luego con TCE01Cr3 en presencia o ausencia de células T primarias, ya sea solas o en combinación con agentes quimioterapéuticos (oxaliplatino o irinotecán) y se monitorearon mediante microscopía de campo claro y fluorescencia a 0, 24 y 48 horas. La viabilidad de las células cancerosas que expresan HLA-C\*01:02 y que fueron pulsadas con el péptido p53R273H, las HUVECs no malignas y las ASCs se evaluaron mediante los cambios en la señal de fluorescencia verde, roja y azul a lo largo del tiempo de incubación. TCE01Cr3 indujo una desintegración progresiva y una pérdida de la fluorescencia verde en condiciones que contenían células T, lo que indica la lisis dirigida de la CRC. El cotratamiento con oxaliplatino o irinotecán no aumentó este efecto, y los controles que carecían de TCE o células T preservaron la integridad del esferoide (Figura 7C). TCE01Cr3 indujo una lisis de esferoides mediada por células T dependiente de la dosis, con una eficacia superior cuando se usó solo en comparación con las combinaciones con oxaliplatino o irinotecán, mientras que las condiciones sin TCE y de control permanecieron en la línea de base (Figura 7D). La secreción de IFN-γ reflejó estas tendencias, con TCE01Cr3 y TCE01Cr3/oxaliplatino que produjeron máximos de aproximadamente 8,42 ng/mL, pero con diferentes valores de CE50 (0,051 y 0,49 nM, respectivamente), seguidos de TCE01Cr3/irinotecán (aproximadamente 5,24 ng/mL, CE50 = 3,3 nM) (Figura 7E).

Los esferoides que albergaban células de CRC con mutaciones endógenas de p53R273H (homocigotas o heterocigotas) se evaluaron de manera similar hasta por 72 horas. TCE01Cr3 indujo una rápida disrupción del esferoide y una pérdida de la fluorescencia de las células vivas en los esferoides de CRC compuestos heterocigotos (R273H/R273H), con efectos intermedios en los esferoides heterocigotos (R273H/R273WT); el TCE01C parental mostró solo una actividad débil (Figura 7F). Las curvas de respuesta dosis revelaron una mayor potencia contra los objetivos homocigotos (79,85% de lisis máxima, CE50 ≈ 2,3 nM) que contra los objetivos heterocigotos (54,32% de lisis máxima, CE50 ≈ 8,2 nM), lo que subraya la sólida eficacia de la variante derivada de ML (Figura 7G). Estos hallazgos destacan la fuerte eficacia independiente de la quimioterapia de la variante optimizada en un modelo tumoral endógeno 3D.

Caracterización y evaluación del TCR dirigido a p53 en el contexto de un receptor de unión de células T

En nuestro estudio anterior, en un intento de establecer un procedimiento para identificar un receptor de células T compartido reactivo a un neoantígeno, se recolectaron y procesaron muestras de pacientes diagnosticados con varios tipos de cáncer.^[31] Entre ellas, había una muestra de cáncer colorrectal que albergaba una mutación puntual en el gen TP53, lo que resultó en la sustitución de la arginina en el codón 273 por histidina (R273H). Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de este paciente se expusieron a péptidos de 25 aminoácidos que correspondían a la región p53 R273 que contenían residuos de tipo salvaje o R273H (SGNLLGRNSFEVRVCACPGRDRRTE o SGNLLGRNSFEVHVCACPGRDRRTE). Se utilizó la evaluación de IFN-γ mediante ELISPOT para evaluar la reactividad de las células T.^[31] Las poblaciones de células T que exhibían un aumento de más de 2 veces cuando se exponían al péptido mutante se sometieron a aislamiento de células individuales y secuenciación de próxima generación (NGS). El análisis de la secuencia de esta muestra identificó un nuevo receptor de células T, designado TCR01 (correspondiente a TCR12.1 en la solicitud de patente 12442046).^[31] Debido a que la selección de clones requirió un umbral funcional (>2 veces de aumento en la secreción de IFN-γ contra el péptido mutante), este enfoque enriquece para los clones de células T con una mayor afinidad relativa para su pHLA cognoscible en comparación con los repertorios no seleccionados o clasificados por tetrámero, lo que es consistente con el fenómeno establecido de la maduración de la afinidad durante la selección clonal de células T impulsada por el antígeno. TCR01 se utilizó en su forma aislada de forma natural, sin una ingeniería de afinidad posterior. Además, la tipificación de HLA de clase I del paciente reveló los siguientes alelos: HLA-A\*02:06, HLA-A\*11:01, HLA-B\*40:01, HLA-B\*54:01, HLA-C\*01:02 y HLA-C\*07:02 (Figuras 1B; Tabla S1). Estos datos sugieren colectivamente que p53R273H puede servir como un posible neoepítopo presentado por uno o más de los alelos HLA de clase I del paciente.^[31] En este estudio, la secuencia del TCR01 identificado se utilizó para diseñar un TCE dirigido a p53R273H. Aunque los estudios preliminares han propuesto TCR candidatos capaces de reconocer el neoepítopo p53R273H, en el momento de este estudio, solo se han informado datos limitados sobre el tinte de tetrámero pHLA/p53R273H o sobre el propio TCR01, particularmente en el contexto de su incorporación en el formato TCE. Para evaluar más a fondo el potencial terapéutico de este enfoque, primero caracterizamos la capacidad de presentación del epítopo p53 de los alelos HLA derivados del paciente, así como la eficacia del TCE basado en TCR01, al que nos referimos como TCE01.

Anteriormente, establecimos una plataforma de receptores de unión de células T incorporando TCR 1-2C, que se dirigía a KRASG12V presentado por HLA-A\*11:01.^[22] Utilizando un enfoque similar, generamos TCE01A, en el que se fusiona un TCR01 de cadena única (sTCR01) al extremo N-terminal de un fragmento de variable de cadena única anti-CD3 (sCD3) seguido de una cola de Fc de cadena única en el formato de "knob-into-hole" [KIH]. La designación TCE01A se utiliza para distinguirlo de otros formatos de TCE que utilizaremos más adelante en este estudio (Figura S1A). Además, diseñamos una línea celular de cáncer colorrectal SW620 para expresar de forma estable los HLA relevantes identificados en la muestra del paciente. Había dos versiones diferentes del mismo HLA diseñadas en la CRC SW620, que incluían la secuencia original y una versión etiquetada con DYKDDDDK (FLAG)-6xHis-DYKDDDDK. Las etiquetas epítopo se insertaron en el extremo C-terminal del dominio alfa 3 (α3) en la región extracelular, inmediatamente antes del extremo N-terminal del dominio transmembrana (TM). Este diseño garantiza la correcta localización de membrana de los HLA diseñados (Figuras S1B y S1C).^[32] Para las células de cáncer de pulmón NCI-H520, las células de cáncer de páncreas PANC-1 y las células de cáncer de mama MDA-MB-468, se diseñó el HLA no etiquetado (Figura S1B).

Para evaluar el potencial de presentación del neoepítopo derivado de p53R273H por los alelos HLA de clase I del paciente, se pulsó la SW620 diseñada con un péptido largo de p53R273H de 25 aminoácidos (20 μM). La citotoxicidad dependiente de las células T se evaluó mediante el cocultivo con células T y TCE01A en un rango de concentración de 10−4 a 101 nM. A las 24 horas, se observó una citotoxicidad mediada por células T superior para las células que presentaban el complejo HLA-C\*01:02/p53R273H, alcanzando hasta aproximadamente el 74,86% de lisis, en comparación con una lisis moderada para HLA-B\*54:01 y una lisis mínima o insignificante para HLA-A\*02:06, HLA-A\*11:01, HLA-B\*40:01, HLA-C\*07:02 y el control simulado (Figura 1C). La alta citotoxicidad observada en HLA-C\*01:02 fue independiente de la presencia o ausencia de etiquetas epítopo utilizadas en nuestras construcciones (Figura S1D). Además, estas observaciones también destacan la potencia alelo-específica del TCE dirigido a p53R273H en el reconocimiento de neoepítopos.

Aunque el péptido de 25 aminoácidos fue diseñado para abarcar los epítopos principales, su procesamiento intracelular y su unión a HLA-C∗01:02 son menos eficientes y más variables. En contraste, el pequeño péptido procesado de 8 a 11 aminoácidos puede unirse directamente a este HLA y resultar en una citotoxicidad mediada por células T robusta. Por lo tanto, es necesario identificar el(los) péptido(s) específico(s) derivado(s) de p53 presentado(s) por HLA-C∗01:02. Para el cribado inicial, utilizamos NetHMCScan 4.1 para predecir y comparar la afinidad de unión de los péptidos derivados de p53R273H (de 8 a 14 aminoácidos) a HLA-C∗01:02, así como a otros alelos HLA derivados del paciente (Tablas S1). Seleccionamos los 5 principales candidatos a péptidos con el mayor potencial de presentación predicho para una evaluación posterior (Figuras 1D; Tablas S2 y S3). En nuestros experimentos, las células SW620 que expresan HLA-C∗01:02 y que fueron incubadas con estos péptidos candidatos mostraron diferentes grados de eficiencia de lisis mediada por células T. En particular, los péptidos de 9 aminoácidos H5 y H6 indujeron una citotoxicidad significativa, mientras que los otros tres candidatos no mostraron diferencias con el control simulado (Figura 1E). Es interesante destacar que las células que expresan HLA-C∗01:02 y que fueron incubadas con el péptido de 9 aminoácidos H5 mostraron una citotoxicidad dependiente de las células T más robusta a una dosis de 0,25 y 0,0625 nM que las células incubadas con el péptido de 25 aminoácidos en las mismas condiciones (Figura 1E).

Ingeniería de TCR01 en diferentes formatos de TCE

En el presente estudio, ampliamos aún más la plataforma TCE previa en términos de posiciones espaciales relativas entre la cadena única de TCR (sTCR) y la cadena única anti-CD3 (sCD3), al tiempo que buscamos equilibrar el tamaño molecular y la estabilidad. Las variantes de TCE se designan como TCE01XrN, donde X denota la arquitectura molecular (A–D; consulte la Figura 1F para los esquemas de dominio y los pesos moleculares) y rN indica la iteración de optimización en el andamio TCE01 (r1 = candidato principal de la primera ronda de ingeniería, r2 = candidato principal de la segunda ronda, r3 = candidato principal de la tercera ronda). Anteriormente, desarrollamos y validamos dos formatos de TCE dirigidos al neoepítopo KRASG12V presentado por HLA-A∗11:01, designados como A y B.^[22] El formato A se describió brevemente en la sección anterior, mientras que el formato B consiste en una sFc KIH que se fusiona en el extremo N-terminal a sTCR y en el extremo C-terminal a sCD3. En ambos formatos, se incluyeron las regiones constantes de las cadenas α y β del TCR para promover el emparejamiento adecuado de las cadenas y mantener la similitud estructural con el TCR nativo.

En este estudio, buscamos reducir el tamaño molecular de nuestras moléculas de TCE minimizando el contenido de dominio, al tiempo que preservamos la afinidad de unión y la funcionalidad del anticuerpo (Figura 1F). A pesar de las similitudes entre los anticuerpos y los TCR, que están compuestos por regiones variables y constantes, los dominios variables del TCR son inherentemente inestables y propensos a plegarse o agregarse incorrectamente sin sus dominios constantes, especialmente en el caso de TCE, donde también se eliminan las regiones transmembrana.^[30],^[33],^[34] En un estudio reciente, Boucher et al. demostraron que retener solo los dominios variables de un anticuerpo es factible mediante la introducción de un residuo de cisteína en cada fragmento variable e incorporando un enlazador que imita la bisagra de la región Fc.^[26] Este enfoque dio como resultado el llamado fragmento de cadena única variable "engrapado" (scFv o spFv). Se ha utilizado un enfoque similar durante el desarrollo de ABBV-184, un TCE bispecífico dirigido a Survivin, diseñado por Chervin et al.; sin embargo, dicho formato solo se mencionó en su patente, pero no en la publicación principal.^[35] En general, a la fecha de este estudio, se han informado aplicaciones limitadas a las moléculas de miniTCE.

En este estudio, adoptamos un enfoque similar al descrito por Boucher et al. para generar el TCE de cadena única "engrapado" que contiene TCR01. El residuo de metionina en la posición 43 de la cadena β se sustituyó por cisteína (M43C), y el residuo de alanina 100 se sustituyó por cisteína (A100C) en la cadena α. Estos residuos se encuentran fuera de la región que determina el complemento (CDR) en ambas cadenas y están posicionados para formar enlaces disulfuro con el enlazador similar a la bisagra que conecta las dos cadenas. El enlazador consistió en dos copias del enlazador flexible G4S, seguido de una secuencia similar a la bisagra CPPC y luego una copia adicional del enlazador G4S (Figura S1E). La distancia predicha entre los átomos de Cα de M42C y A100C fue de 4,0 Å, y la distancia predicha entre los dos residuos de cisteína en el enlazador fue de 6,8 Å (Figuras S1E y S1F). Estos valores se encuentran dentro del rango típico observado para las distancias Cα-Cα en la región de la bisagra del anticuerpo IgG estándar, aproximadamente de 5,0 a 7,0 Å. La implementación del enfoque "engrapado" generó dos plataformas adicionales utilizadas en este estudio (Figura 1F). Esta estrategia redujo el peso molecular teórico de TCE01 de 130,38 kDa (en TCE01A y TCE01B) a aproximadamente 104,80 kDa (en TCE01C y TCE01D), lo que corresponde a una reducción del 24,40 % (Figuras 1F y S1G).

Se utilizó interferometría de capa biológica (BLI) para evaluar la afinidad de unión de las variantes de TCE01 para el complejo pHLA-C∗01:02/p53R273H de 9 aminoácidos (H5). El pHLA-C∗01:02/p53R273H de 9 aminoácidos H5 se inmovilizó en el biosensor y la unión de las variantes de TCE01 se realizó en una dilución serial de 3 pliegues. Todas las variantes de TCE01 (A–D) mostraron afinidades de unión comparables al complejo pHLA-C∗01:02/p53R273H de 9 aminoácidos H5 inmovilizado, con valores de constante de disociación (Kd) de 17,43 nM (TCE01A), 18,58 nM (TCE01B), 20,22 nM (TCE01C) y 25,21 nM (TCE01D). Estos resultados indican que el formato "engrapado" conserva eficazmente la actividad de unión original (Figura 1G). Los valores de Kd obtenidos para las variantes de TCE01 (17–25 nM) son más altos que el rango de afinidad que se informa habitualmente para las interacciones TCR-pHLA naturales (1–100 μM). Esto es consistente con el aislamiento de TCR01 mediante un cribado basado en la avidez funcional en lugar del muestreo de repertorio convencional o clasificado por tetrámero (ver arriba). También observamos que, dado que el ligando pHLA se inmovilizó como un tetrámero basado en la estreptavidina, los valores de Kd informados representan afinidades aparentes que pueden verse influenciadas por la avidez local/efectos de re-unión en la superficie del sensor en lugar de reflejar estrictamente la afinidad monomérica 1:1 intrínseca.

A continuación, evaluamos las afinidades de unión a nivel celular de los constructos de TCE a CD3 y a las células diana HLA-C∗01:02 que expresan p53R273H mediante citometría de flujo. Todas las variantes de TCE01A, TCE01B, TCE01C y TCE01D exhibieron una alta afinidad de unión a CD3ε en las células T con valores de Kd de 2,544 nM, 2,322 nM, 2,467 nM y 2,763 nM, respectivamente. Todos estos valores son más altos (menor afinidad) que el anticuerpo anti-CD3 original en 136,3 pM (Figura 1H).^[22] Coherente con los resultados de BLI, la unión de las variantes de TCE01 a las células SW620 que expresan HLA-C∗01:02 y que fueron incubadas con el péptido p53R273H de 9 aminoácidos H5 no mostró diferencias significativas entre TCE01A-D con un Kd de 121,42 nM (TCE01A), 134,11 nM (TCE01B), 101,24 nM (TCE01C) y 112,52 nM (TCE01D) (Figuras 1I y 1J).

Vale la pena señalar las diferencias de rendimiento entre las versiones "engrapadas" (TCE01C y TCE01D) y las versiones no "engrapadas" (designadas con el signo ∗, por ejemplo, TCE01C∗ y TCE01D∗). En condiciones similares, observamos una reducción notable en la afinidad de unión con valores de Kd de 60,42 nM para TCE01C∗ (en comparación con 20,22 nM para TCE01C) y 78,73 nM para TCE01D∗ (en comparación con 25,21 nM en TCE01D) (Figura S1H). Además, las variantes de TCE no "engrapadas" (TCE01C∗ y TCE01D∗) mostraron nuevamente una unión a nivel celular relativamente más débil a las células SW620 que expresan HLA-C∗01:02 y que fueron incubadas con el péptido p53R273H, en comparación con sus versiones "engrapadas" TCE01C y TCE01D, lo que es coherente con el enfoque BLI (Figura S1I). Para simplificar, a partir de ahora, nos centraremos únicamente en las versiones "engrapadas" con TCE01C y TCE01D. Estos datos demuestran en conjunto que TCE01A-D conservan la unión bispecífica tanto al complejo pHLA-C∗01:02/p53R273H de 9 aminoácidos H5 a través del motivo TCR, así como a CD3ε a través del motivo anti-CD3, y, lo que es importante, el enfoque "engrapado" se puede utilizar como una opción potencial para reducir aún más el tamaño de la región del TCR que se incorporará en los formatos de TCE.

El TCE dirigido a p53R273H, TCE01, promueve la citotoxicidad mediada por células T in vitro

Para investigar la capacidad de las variantes de TCE01 para activar las células T y mediar la muerte de las células diana, las moléculas de TCE se cocultivaron con células SW620 de CRC que expresan HLA-C∗01:02 y que fueron incubadas con el péptido p53R273H de 9 aminoácidos H5 y con células T humanas primarias de forma dependiente de la dosis. La viabilidad de las células diana se cuantificó a las 24 horas posteriores al cocultivo mediante el ensayo de luminiscencia ATP de CellTiter-Glo. A pesar de las afinidades de unión comparables entre las variantes, TCE01A demostró una eficacia citotóxica reducida, con una lisis específica máxima del 72,24 %. TCE01B alcanzó una citotoxicidad máxima del 78,62 %, mientras que TCE01C y TCE01D indujeron una citotoxicidad más alta, con máximos del 92,52 % y 95,26 %, respectivamente (Figura 2A). Todas las cuatro variantes de TCE01 lograron una citotoxicidad casi máxima a una concentración ≥0,01 nM, con una lisis específica óptima observada a 0,625 nM y superior (Figura 2A). La activación de las células T inducida por las variantes de TCE01 se evaluó además midiendo la expresión de CD69 mediante citometría de flujo. TCE01A y TCE01B produjeron frecuencias máximas de CD69+ del 62,14 % y 70,22 %, respectivamente, que fueron sustancialmente más bajas que las observadas para TCE01C (87,24 %) y TCE01D (86,82 %) en condiciones equivalentes. Este patrón se alineó con la tendencia observada en la citotoxicidad mediada por células T (Figura 2B).

Además, analizamos la liberación de gránulos citolíticos de las células T activadas por TCE mediante citometría de flujo para cuantificar la perforina y la granzima B. La expresión de la granzima B aumentó en las muestras tratadas con TCE01, con frecuencias del 44,15 % para TCE01A, 62,51 % para TCE01B, 78,42 % para TCE01C y 71,22 % para TCE01D, lo que es coherente con el perfil de activación de CD69 y el resultado de la citotoxicidad mediada por células T (Figura 2C). De manera similar, la expresión de perforina siguió una tendencia similar, aunque con frecuencias más bajas (40,05 % para TCE01A, 48,51 % para TCE01B, 62,21 % para TCE01C y 59,25 % para TCE01D) (Figura 2D). En línea con estos marcadores de activación y función citolítica, la secreción de interferón gamma (IFN-γ) exhibió un patrón dependiente de la dosis comparable entre las variantes de TCE01 (Figura 2E). En conjunto, la capacidad de las variantes de TCE01 para unirse, reclutar y activar las células T les permite promover eficazmente la citotoxicidad contra las células de CRC que expresan pHLA-C∗01:02/p53R273H (Figura 2F).

Exploración de la sensibilidad de las variantes de TCE dirigidas a p53R273H en modelos 2D y 3D

Para investigar la sensibilidad de las variantes de TCE01, las células T humanas primarias se co-incubaron con células diana a varias relaciones E:T (0:1, 0:1, 0,5:1, 1:1, 2:1, 5:1 y 10:1), manteniendo constantes las concentraciones de TCE. Los datos mostraron que TCE01A y TCE01B lograron una citotoxicidad óptima a partir de una relación E:T de 5:1, alcanzando el 68,52 % y el 76,24 %, respectivamente. En contraste, TCE01C y TCE01D indujeron una citotoxicidad significativa a una relación E:T de 2:1, con eficiencias de eliminación superiores al 70 % y aumentando aún más hasta aproximadamente el 92,56 % y el 94,52 %, respectivamente (Figura S2A). En los análisis de la serie temporal, TCE01C y TCE01D lograron una muerte celular mediada por células T casi completa a las 24 horas posteriores al cocultivo, mientras que TCE01A y TCE01B requirieron hasta 48 horas para superar el 90 % de citotoxicidad (Figura S2B). En conjunto, estos hallazgos indican que el miniTCE (plataformas C y D) no solo reduce el peso molecular de las moléculas receptoras de células T, sino que también mejora sustancialmente su eficacia funcional. En consecuencia, los análisis posteriores se centraron en la variante TCE01C debido a su perfil superior en términos de peso molecular y potencia.

A continuación, examinamos la eficacia de TCE01C utilizando células T primarias derivadas de múltiples donantes sanos, reconociendo la variabilidad sustancial en los perfiles inmunitarios. Los pacientes presentan respuestas diferenciales a inmunoterapias idénticas, lo que destaca la importancia de evaluar la capacidad de TCE01C para reclutar y activar células T de múltiples donantes.^[36] En siete donantes sanos, la CE50 de TCE01C para la citotoxicidad mediada por células T osciló entre 0,62 pM (donante n.º 004, IC del 95 %: 0,58–0,68 pM) y 2862 pM (donante n.º 006; IC del 95 %, 1863–6183 pM), lo que representa un rango de aproximadamente 4600 veces (ANOVA de una vía sobre la CE50 transformada logarítmicamente, F6’14 = 490,3, p < 0,0001; prueba t de Welch para el donante n.º 004 frente al n.º 006, t = 25,5, gl = 2,2, p = 0,001), lo que subraya la importante variabilidad interdonante en la respuesta de las células T (Figura 2G).

Para investigar más a fondo la potencia de TCE01C en modelos fisiológicamente relevantes, evaluamos su actividad en sistemas de esferoides 3D. Dado que los modelos 3D se utilizan cada vez más para la evaluación preclínica de la eficacia de los fármacos en el cáncer y otras enfermedades,^[37],^[38],^[39] generamos esferoides compuestos por células de cáncer colorrectal (CCR) que expresan HLA-C∗01:02, células madre derivadas de tejido adiposo humano (ASCs) y células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs), y los incubamos con el péptido p53 R273H. Cabe destacar que solo las células de cáncer colorrectal dentro de los esferoides se diseñaron para expresar HLA-C∗01:02, mientras que todo el esferoide se incubó con el péptido de 9 aminoácidos p53 R273H (H5). Este diseño experimental recapitula parcialmente la heterogeneidad observada en las muestras tumorales derivadas de pacientes, en las que la expresión de HLA es variable entre los subconjuntos de células y no todas las células del microambiente tumoral presentan el antígeno diana. Estos esferoides se cocultivaron con células T primarias y TCE01C de forma dependiente de la dosis (Figura 2H). Los efectos terapéuticos se cuantificaron mediante ensayos basados en la fluorescencia y la secreción de IFN-γ. TCE01C eliminó el 82,45 % de las células de CCR en 48 horas, acompañado de una liberación máxima de IFN-γ de 9,2 ng/mL, al tiempo que mostraba una citotoxicidad mínima o nula hacia las ASC y las HUVECs no malignas (Figuras 2I–2K). En conjunto, estos hallazgos destacan la sólida eficacia de TCE01C en diversas células T derivadas de pacientes y en complejos microambientes tumorales 3D.

Especificidad de TCE01C

Investigar la especificidad de los activadores de células T bispecíficos es fundamental para su desarrollo terapéutico exitoso. Para TCE01C, que se dirige a p53R273H, la especificidad se evaluó en múltiples dimensiones: (1) especificidad del péptido, evaluada mediante el análisis de los residuos clave de interacción y los péptidos homólogos, (2) restricción de HLA, determinada mediante la comparación del reconocimiento de p53R273H presentado por diferentes alelos de HLA y (3) sensibilidad de TCE a los péptidos presentados específicamente por HLA-C∗01:02. Dado que el epítopo de 9 aminoácidos p53R273H (H5) es presentado por HLA-C∗01:02, los péptidos estructuralmente similares también pueden ser presentados por esta molécula de HLA, lo que podría inducir cambios conformacionales que faciliten la unión de TCE y la citotoxicidad dependiente de las células T. Para explorar esta posibilidad, primero diseñamos y sintetizamos un panel de péptidos de 9 aminoácidos que contienen sustituciones en la posición del codón 273 de p53, análogos al péptido de 9 aminoácidos p53R273H (H5) utilizado aquí. Estos incluyeron variantes con asociaciones documentadas o predichas con el inicio y la progresión de diversos cánceres (Tablas S2 y S4), que abarcan R273H, R273C, R273L, R273G, R273P y R273S. Entre estas variantes de p53R273, TCE01C provocó la muerte mediada por células T contra cuatro variantes: el objetivo principal R273H, así como R273C, R273L y, inesperadamente, R273 de tipo salvaje (R273WT). Los ensayos de unión en células corroboraron estos hallazgos, mostrando claros cambios de población que indican la unión de TCE01C con los mismos cuatro objetivos (Figuras 3A y 3B). Además, titulamos los péptidos p53 R273H, R273WT y R273C de 0,002 a 20 000 nM. Las tres variantes alcanzaron una eficacia casi máxima a 2000 nM, siendo R273H el que mostró una mayor potencia en comparación con los demás (Figura S2C). Estos resultados demostraron que TCE01C reconoce y se une funcionalmente a otras variantes de p53 R273 más allá del objetivo previsto p53R273H.^[1],^[40] Cabe destacar que, dado que la proteína p53 de tipo salvaje se somete a una degradación proteasómica continua y a una presentación en el MHC en las células normales, el reconocimiento observado del péptido p53 R273WT por parte de TCE01C es particularmente preocupante, ya que demuestra la alta sensibilidad de la molécula hacia la secuencia de tipo salvaje. Además, examinamos posteriormente la actividad de TCE01C contra péptidos homólogos al péptido p53 R273H de 9 aminoácidos (H5) (Tabla S4). Se realizaron búsquedas de homología utilizando NCBI Blast y ExPAsy’s ScanProsite, permitiendo hasta siete desajustes como umbral.^[15],^[22],^[35],^[41],^[42] Cabe destacar que no se identificaron péptidos fuera del objetivo con un solo desajuste fuera de la posición R273 (quinto residuo en el péptido de 9 aminoácidos). Entre estos objetivos fuera del objetivo, TCE01C exhibió una actividad detectable únicamente contra el objetivo fuera del objetivo 01 (SFEIHVCSC) (Figura 3C).

La actividad observada de TCE01C hacia las variantes de R273, pero la respuesta limitada a los posibles objetivos fuera del objetivo, sugiere posibles efectos fuera del objetivo que podrían atribuirse a (1) propiedades intrínsecas de unión de TCE, (2) residuos críticos de interacción de péptidos o (3) capacidad de presentación de HLA-C∗01:02. Para investigar esto, realizamos un escaneo de alanina generando variantes de alanina sustituida única en cada posición (P1–P9) del péptido p53R273H de 9 aminoácidos (H5) y evaluamos la actividad funcional de TCE01C en los ensayos CellTiter-Glo (Tabla S4). De los ocho péptidos de alanina sustituida, solo la variante V6A conservó la actividad total comparable al péptido original p53R273H de 9 aminoácidos (H5). Las sustituciones S1A, H5A y C7A redujeron la eficacia de TCE01C en aproximadamente un 50 %, mientras que las sustituciones E3A y C9A causaron una reducción sustancial. Cabe destacar que las sustituciones de alanina en las posiciones F2A o V4A abolieron por completo la actividad funcional de TCE01C (Figura 3D). Dado que TCE01C también reconoció el péptido p53 R273H de 9 aminoácidos (H6) con una eficacia moderada (Figura 1E), ampliamos el escaneo de alanina a cada posición de este péptido (Tabla S4). Se observó una abolición completa en las sustituciones S2A, E4A y C8A, mientras que N1A y V5A indujeron una reducción parcial de la eficacia, lo que refleja los patrones en las variantes de alanina del péptido p53 R273H de 9 aminoácidos (H5). Por el contrario, las sustituciones F3A, H6A y V7A no perjudicaron la función de TCE01C (Figura 3E). En conjunto, estos datos indican que los residuos segundo, cuarto y octavo del péptido p53 R273H de 9 aminoácidos son fundamentales para la presentación de HLA-C∗01:02 y la eficacia de unión de TCE01C.

Para dilucidar la base estructural de las interacciones de TCE01C, empleamos enfoques de modelado computacional de última generación, específicamente Boltz-2 y AlphaFold 3, para predecir el complejo ternario que comprende TCE01C, HLA-C∗01:02 con el péptido p53R273H de 9 aminoácidos (H5), el péptido p53R273H de 9 aminoácidos (H6) o el péptido p53R273H de 10 aminoácidos (H9).^[43],^[44] Se generaron estos modelos para identificar los residuos críticos para el complejo. De acuerdo con nuestros hallazgos in vitro, se predijo que los residuos segundo y octavo son esenciales para la presentación estable de los péptidos de 9 aminoácidos (H5 y H6), mientras que el segundo residuo del péptido de 10 aminoácidos (H9) exhibió inestabilidad dentro del complejo ternario. Además, se predijo que el cuarto residuo en el péptido de 9 aminoácidos (H5) también contribuye a la estabilización del complejo, de modo que la sustitución de alanina en esta posición perjudicó notablemente tanto la presentación del péptido como la eficacia de unión de TCE01C (Figuras S2D–S2F). En estos modelos, surgió un patrón congruente con respecto a los factores clave que rigen la integridad del complejo.

Optimización computacional de TCE dirigido a p53R273H

La reactividad cruzada observada de TCE01C hacia las variantes de R273, junto con las respuestas limitadas a los posibles objetivos fuera del objetivo, sugiere su posible utilidad para dirigirse a otras variantes de p53 R273 en diversos tipos de cáncer, especialmente dado que R273 de p53 representa una mutación de punto caliente en las neoplasias humanas. Un TCE capaz de reconocer múltiples variantes podría funcionar como una terapia lista para usar, aplicable a una cohorte de pacientes más amplia que abarque diversas indicaciones tumorales. La evidencia de respaldo demuestra que las moléculas de TCE que se unen a múltiples antígenos o variantes asociados al tumor confieren un mejor reconocimiento tumoral y una mayor eficacia antitumoral en relación con las que tienen una especificidad de un solo objetivo estricta.^[45] Sin embargo, esta especificidad ampliada aumenta el riesgo de reactividad cruzada con el p53 de tipo salvaje u otros péptidos propios no relacionados, que pueden surgir de forma estocástica en una población de pacientes heterogénea en función de las condiciones individuales.^[46],^[47] Aunque la proteína p53 mutada R273H generalmente está ausente en las células normales, el reconocimiento inadvertido del p53 de tipo salvaje podría desencadenar una grave autoinmunidad sistémica o toxicidad en el objetivo/fuera del objetivo.^[5],^[48],^[49] Además, los TCR que pueden dirigirse a varias variantes pueden exhibir una afinidad disminuida por los objetivos individuales, lo que limita la activación de las células T y la potencia tumoricida. Para abordar este posible compromiso entre la amplitud y la potencia, seguimos optimizando nuestra plataforma de TCE, priorizando las mejoras en el dominio TCR en el contexto de la arquitectura de TCE.

Primero, predijimos la estructura del complejo pHLA-C∗01:02/péptido p53R273H de 9 aminoácidos (H5) utilizando tres programas de modelado computacional independientes: AlphaFold 3, Boltz-2 y TCRmodel2.^[43],^[44],^[50] Aunque AlphaFold3 y Boltz-2 son modelos más generalistas, Boltz-2 es abierto, rápido y controlable, mientras que Alphafold3 proporciona la mayor precisión general. Se generaron varios modelos en paralelo utilizando estos dos modelos y se clasificaron por la puntuación ipTM. Por otro lado, TCRmodel2 se entrenó en base a una base de datos de acoplamiento de TCR y se utilizó en este enfoque para la validación cruzada. La estructura de pHLA superior se utilizará para predecir la estructura del complejo con la adición de TCE01C utilizando los modelos mencionados anteriormente. Aprovechando esta estructura, realizamos una evolución dirigida guiada por aprendizaje automático utilizando tres herramientas de diseño de proteínas complementarias: EvoPro, EvoProtGrad y Antibody Evol^[27],^[51],^[52],^[53] (Figura 4A). Los candidatos emergentes se evaluaron para (1) afinidad de unión prevista (ddG, Prodigy y BoltzGen), (2) estabilidad estructural (DeepSP y Aggrescan 3D), (3) inmunogenicidad (ABImmpred y Hu-mAb) y (4) toxicidad (TAP).^[44],^[54],^[55],^[56],^[57] Entre estos criterios, la afinidad de unión se utilizó para clasificar a los mejores candidatos, mientras que los últimos, incluida la estabilidad y la inmunogenicidad, se incluyeron para predecir la seguridad y la eficacia de los candidatos generados. El candidato con la clasificación más alta de cada iteración sirvió como secuencia parental para las rondas posteriores de evolución dirigida, con los residuos optimizados fijados posteriormente. Este flujo de trabajo iterativo se completó después de tres ciclos de evolución dirigida computacional (Figuras 4A y S3A; Tabla S5). Cabe destacar que las modificaciones evolutivas no se limitaron a las CDR, ya que la evidencia acumulada subraya las contribuciones de los dominios no CDR a la dinámica conformacional, la afinidad de unión, la estabilidad de la interfaz y la eficacia funcional general en los anticuerpos y los activadores relacionados.^[58],^[59],^[60],^[61] El modelado del complejo ternario TCE01C/pHLA-C∗01:02/péptido p53R273H de 9 aminoácidos (H5) reveló una unión asimétrica restringida a un lado del surco de unión del péptido HLA, junto con un posicionamiento desproporcionado de las cadenas α/β, con la cadena α orientada (Figuras 4B y S3B). Las investigaciones previas han establecido el papel fundamental de CDR3β en la funcionalidad de TCR. Los candidatos optimizados por aprendizaje automático exhibieron refinamientos conformacionales progresivos, facilitando una interacción completa en el surco de unión del péptido y una alineación equitativa de ambas cadenas de TCR hacia el epítopo (Figuras S3C–S3E).

Los activadores optimizados mostraron una mayor eficacia de unión a nivel celular hacia el complejo pHLA-C∗01:02/péptido p53R273H de 9 aminoácidos (H5).

Uno de los desafíos actuales en el desarrollo de nuevas proteínas mediante programación computacional es confirmar si el rendimiento previsto de nuevas variantes in silico se traduce fielmente en la realidad experimental tanto en modelos 2D como 3D. Para mitigar este riesgo y superar la brecha in silico- in vitro, los principales candidatos de cada ronda evolutiva de evolución dirigida se sometieron a una validación empírica en ensayos basados en células antes de su avance. Los candidatos se evaluaron para determinar su eficiencia de unión y su citotoxicidad dependiente de las células T. El BLI reveló mejoras progresivas en la afinidad del TCR para el complejo pHLA-C∗01:02/p53R273H 9-mer H5 estabilizado, con valores de Kd que disminuyeron de 20,22 nM (TCE01C) a 12,51 nM (TCE01Cr1), 3,12 nM (TCE01Cr2) y, para la variante principal final, 2,51 nM (TCE01Cr3) (Figura 4C). Este aumento en la afinidad de unión in vitro se alinea estrechamente con la correspondiente disminución de los valores de Kd predichos obtenidos de las evaluaciones in silico a lo largo de las rondas de optimización (Tabla S5). Los ensayos de unión en células confirmaron aún más estas mejoras, demostrando afinidades progresivamente mejoradas para el complejo diana pHLA-C∗01:02/p53R273H en las variantes sucesivas. El candidato principal final, TCE01Cr3, exhibió la señal de unión en células más fuerte, lo que es consistente con su perfil biofísico superior (Figuras 4C–4E).

Para comparar las potencias funcionales de las variantes de TCE optimizadas dirigidas a p53R273H, cuantificamos la citotoxicidad mediada por células T y la liberación de citocinas en cocultivos con SW620 que expresan HLA-C∗01:02 y que fueron pulsadas con el péptido p53R273H 9-mer H5. Las curvas de respuesta a la dosis para la lisis específica revelaron perfiles sigmoideos para todos los constructos de TCE, con una lisis máxima que se acercaba al 100% a concentraciones más altas. La variante optimizada principal, TCE01Cr3 (naranja), exhibió la mayor potencia (EC50 ≈ 10–5 nM), seguida de TCE01Cr2 (azul; EC50 ≈ 2 × 10−5 nM), TCE01Cr1 (verde; EC^[44] ≈ 6 × 10−4 nM) y el TCE01C parental (rojo; EC50 ≈ 5 × 10−3 nM). Las condiciones de control (TCR-Fc, CD3-Fc y células solamente) mostraron una actividad insignificante (Figura 5A). De manera similar, la secreción de IFN-γ siguió tendencias análogas, con TCE01Cr3 alcanzando la máxima liberación (∼7,85 ng/mL; EC50 ≈ 5 × 10−4 nM), superando a TCE01Cr2 (EC50 ≈ 10–3 nM), TCE01Cr1 (EC50 ≈ 5 × 10−3 nM) y TCE01C (EC50 ≈ 10–2 nM), mientras que los controles se mantuvieron en los niveles basales (Figura 5B). A continuación, evaluamos la dependencia del efecto citotóxico mediado por TCE en las relaciones efector-diana (0:1, 0,1:1, 0,5:1, 1:1, 2:1, 5:1 y 10:1). Las cuatro variantes, TCE01C, TCE01Cr1, TCE01Cr2 y TCE01Cr3, indujeron una fuerte lisis de las células diana incluso a bajas relaciones E:T (tan bajas como 1:1), con una lisis máxima superior al 85% alcanzada a relaciones E:T de 5:1 y 10:1. A una relación E:T de 1:1, TCE01Cr2 y TCE01Cr3 lograron una citotoxicidad significativamente mayor que TCE01C y TCE01Cr1 (ANOVA de una vía, F3’8 = 56,5, p < 0,001), con diferencias por pares que oscilaron entre 1,8 veces (TCE01Cr2 vs. TCE01C, p ajustada de Tukey = 0,0007) y 2,8 veces (TCE01Cr3 vs. TCE01Cr1, p ajustada de Tukey < 0,001). A una relación E:T de 2:1, se observó el mismo orden de clasificación, pero las diferencias fueron menores y solo parcialmente significativas (F3’8 = 7,5, p = 0,010 en general). Solo TCE01Cr3 vs. TCE01Cr1 siguió siendo significativo después de la corrección (1,4 veces, p = 0,007), mientras que TCE01Cr2 vs. TCE01C no lo fue (1,06 veces, p = 0,85) (Figura 5C). Integrando las predicciones computacionales, los datos de unión biofísica y los datos celulares preliminares, TCE01Cr3 surgió como el candidato principal para una evaluación avanzada. Posteriormente, las evaluaciones se centraron principalmente en TCE01Cr3, incorporando variantes auxiliares cuando fue pertinente.

TCE01Cr3 demostró una mayor fidelidad en el tetrámero HLA-C∗01:02/p53R273H 9-mer H5

De manera similar al TCE01C parental, fue imprescindible realizar un perfil de especificidad exhaustivo del TCE01Cr3 optimizado mediante ML. Los ensayos de cocultivo demostraron una robusta lisis mediada por células T de las células diana que presentaban el neoantígeno p53R273H, con una lisis específica máxima que superaba el 80%. Todavía se detectó una citotoxicidad residual contra las células pulsadas con los péptidos R273C y R273 de tipo salvaje, aunque la magnitud de la lisis se redujo sustancialmente en comparación con el TCE01C parental (Figura 3A). En contraste, no se elicitó ninguna respuesta medible contra las células pulsadas con R273L, R273G, R273P, R273S o controles sin péptido (Figura 5D). TCE01Cr3 exhibió una fuerte unión a las células SW620 pulsadas con el péptido p53 R273H 9-mer, una unión moderada a los péptidos R273C y R273 de tipo salvaje, y ninguna unión detectable a los péptidos R273L, R273G, R273P, R273S o controles sin péptido (Figura 5E). Cabe destacar que, en este enfoque, los péptidos que contienen estas variantes de p53 R273 se pulsaron a una dosis de 20 μM, que es una de las dosis más altas de péptido que se utilizan en estudios similares ^[23], ^[39], ^[62] y que está muy por encima de la capacidad de presentación normal del neoantígeno nativo. Para el p53 R273 9-mer que contiene ya sea R273H, R273WT o R273C, que desencadenaron la citotoxicidad mediada por TCE de TCE01Cr3, se evaluó la sensibilidad en la forma dependiente de la dosis del péptido que oscila entre 20 000 y 0,002 nM. La lisis específica alcanzó un máximo de ∼88–90% a concentraciones más altas de péptido R273H a partir de 2 a 20 000 nM, con una EC50 en el rango nanomolar. En contraste, tanto el péptido mutante R273WT como el R273C solo desencadenaron la muerte mediada por TCE a una dosis de 20 000 nM de péptido y se redujeron drásticamente a dosis más bajas (Figura 5F). La pulsación con el péptido R273WT de tipo salvaje resultó en una lisis insignificante en todo el rango de concentración. El mutante R273C estrechamente relacionado indujo solo una lisis mínima a las concentraciones más altas probadas, lo que confirmó una fuerte discriminación contra la secuencia de tipo salvaje y esta variante de un solo aminoácido.

Las evaluaciones fuera del objetivo produjeron una lisis robusta (>80% de máximo) exclusivamente para el objetivo R273H, con una actividad insignificante contra homólogos o controles (Figura 5G). Los ensayos de restricción alélica confirmaron una lisis potente y específica exclusivamente para HLA-C∗01:02 pulsado con p53R273H 9-mer H5, con respuestas insignificantes a HLA-A∗02:06, HLA-A∗11:01, HLA-B∗40:01, HLA-B∗54:01, HLA-C∗07:02 o controles (Figura 5H). Estos resultados confirman la exquisita especificidad alélica y de péptido de TCE01Cr3 para el complejo HLA-C∗01:02–p53R273H.

De manera similar, el escaneo de alanina del epítopo principal p53R273H 9-mer H5 (SFEVHVCAC) identificó los residuos F2, E3, V4, H5, V6 y C7 como críticos, con sustituciones que provocaron reducciones marcadas o la abolición de la lisis, mientras que S1A y C9A todavía exhibieron una citotoxicidad débil (Figura 5I). El mapeo in silico del complejo ternario de TCE, B2M/HLA-C∗01:02 y p53R273H 9-mer H5 destacó la participación predominante de CDR, con CDRβ1, CDRβ2 y CDRα3 que favorecen los contactos con HLA-C∗01:02, y CDR3α/β involucrados tanto en la interacción con HLA como con el péptido, de manera similar a estudios previos sobre otras interacciones TCR/HLA/péptido ^[22], ^[35], ^[63]. La optimización computacional amplificó notablemente la participación de CDR3 con los residuos del péptido que se presenta, junto con una interacción aumentada con HLA-C∗01:02 (Figura S3B; Tabla S6). Por otro lado, si bien el escaneo de alanina en el péptido que se presenta nos permite identificar rápidamente los residuos críticos en los que las interacciones de la cadena lateral pueden contribuir significativamente a la afinidad o especificidad de unión, investigamos más a fondo el perfil de especificidad completo, particularmente para los residuos esenciales para anclar el péptido p53 R273H 9-mer en HLA-C∗01:02 o los residuos involucrados en la interacción con el TCR, a saber, las posiciones 2, 5, 6 y 8 (P2, P5, P6 y P8). Los estudios estructurales de otros complejos HLA/TCR han sugerido un patrón en el que P2 y P8 son esenciales para la presentación adecuada del péptido en HLA, mientras que P5 y P6 están más involucrados en la interacción con el TCR ^[62], ^[64], ^[65], ^[66]. Este enfoque es necesario, especialmente en el caso del péptido p53 R273H 9-mer H5 en este estudio, ya que la posición P8 es el residuo de alanina (SFEVHVCAC), que no se puede examinar más a partir de la perspectiva del escaneo de alanina. Se generó una biblioteca de péptidos combinatorios donde cada uno de los residuos en la posición 2, 5, 6, 8, correspondiente a F2, H5, V6, A8, respectivamente, se sustituyó con 20 aminoácidos (Figura 6A). Se probaron las respuestas de TCE01C y TCE01Cr3 con células diana mediante citotoxicidad CellTiter-Glo 2D. Para la posición #2, observamos una alta tolerancia de TCE01C para los aminoácidos hidrofóbicos, especialmente para los que tienen una cadena lateral aromática similar al residuo original Fenilalanina (F) (Figura 6B). La versión optimizada, TCE01Cr3, exhibió una reducción sustancial en la tolerancia; sin embargo, todavía tiene alguna actividad fuera del objetivo detectable si esta posición se cambia a la categoría hidrofóbica, aunque a un nivel más bajo (Figura 6B). Para la posición #5, TCE01C mostró algunos niveles de tolerancia hacia los aminoácidos hidrofóbicos, especialmente para los residuos cargados negativamente además de algunos hidrofóbicos como Alanina (A) o Leucina (L). TCE01Cr3 optimizado fue en general más sensible a la sustitución en esta posición con residuos hidrofílicos como C5, N5, K5 (Figura 6C). La posición #6 mostró un gran problema fuera del objetivo para TCE01C si se sustituye por la categoría hidrofóbica, especialmente para el grupo alifático. Este problema se resolvió por completo en TCE01Cr3 cuando solo fue sensible al residuo Valina en la posición 6. La reactividad cruzada en el anclaje C-terminal teórico A8 se observó contra la sustitución con otros aminoácidos que también pertenecen a la familia hidrofóbica además de los residuos hidrofílicos T8 y Q8 para TCE01C. Por otro lado, TCE01Cr3 muestra una mayor fidelidad estricta en esta posición con solo Alanina que muestra una citotoxicidad robusta (Figura 6E).

Luego, intentamos utilizar ScanProsite para analizar péptidos homólogos que cumplan con los motivos responsivos de TCE01Cr3 observados a partir del análisis de la biblioteca combinatoria de péptidos anterior. Este análisis da como resultado cuatro péptidos homólogos adicionales (Uniprot: A0R2I7, SAEVHVVTC; Uniprot: A3QFJ5, SSEVKVCAD; Uniprot: E1BBQ2, SEEVHVCLP; y Uniprot: P34388, IPEVHVCAV). Estos cuatro péptidos homólogos adicionales tienen de 3 a 4 desajustes en comparación con el péptido p53 R273H 9-mer H5 que utilizamos a lo largo de este estudio. Sin embargo, ninguno de ellos proviene del genoma humano (Tabla S4). Además, también se investigó la sensibilidad contra los péptidos presentados por HLA-C∗01:02. La interacción con HLA-C∗01:02 anclará las regiones del TCR de TCE01Cr3 en las posiciones en las que están expuestas a los péptidos presentados por este HLA, y por lo tanto, puede desencadenar una posible actividad fuera del objetivo. Como resultado, la evaluación de los péptidos presentados por este HLA puede proporcionarnos otra información sobre la especificidad de TCE01Cr3. Utilizando la base de datos y las herramientas de epítopos inmunitarios (IEDB), encontramos 2924 péptidos que se informó que se presentan con HLA-C∗01:02. Basándonos en el patrón fuera del objetivo cuando se realiza un escaneo de 20 aminoácidos para TCE01Cr3 en el péptido p53 R273H 9-mer, seleccionamos los 10 candidatos principales para evaluaciones rápidas (Tabla S4, fuera del objetivo 17-26). Estos candidatos tienen todos Fenilalanina en la segunda posición (P2), lo que coincide con el péptido p53 R273H 9-mer y puede servir como un importante punto de anclaje para la presentación del péptido. Además, también tienen coincidencias en la quinta (fuera del objetivo 18), sexta (fuera del objetivo 17-24) o octava (fuera del objetivo 17, 25, 26) posiciones, lo que los hace más vulnerables al reconocimiento de TCE01Cr3. Se realizó un ensayo de citotoxicidad dependiente de las células T para estos candidatos en comparación con el péptido p53 R273H 9-mer H5. En nuestras manos, estos 10 candidatos no desencadenaron una actividad significativa fuera del objetivo de TCE01Cr3, con la excepción del fuera del objetivo 17, que también tiene los residuos F2, V6 y A8, similares al péptido p53 R273H 9-mer (Figura 6F).

Respuesta inmune de TCE01Cr3 en diversos tipos de células

Examinamos más a fondo la eficacia de TCE01Cr3 contra la expresión endógena de p53R273H utilizando la línea celular de cáncer colorrectal SW620, que alberga la mutación heterocigota p53R273H.^[54] En los ensayos iniciales de citotoxicidad utilizando células SW620 modificadas para expresar HLA-C∗01:02 y tratadas con el péptido p53 R273H, se observó una lisis específica de la línea base del 15-20%, incluso a bajas dosis de las variantes optimizadas (TCE01Cr1, TCE01Cr2 y TCE01Cr3), mientras que la TCE01C parental no mostró actividad detectable en las mismas condiciones (Figura 5A), lo que llevó a investigar la hipersensibilidad o la reactividad cruzada. Si bien la reactividad cruzada de TCE01Cr3 se investigó parcialmente mediante el cribado de efectos no deseados, el escaneo de alanina y el cribado combinatorio de péptidos en residuos esenciales (Figuras 5D-5I y 6A-6E), aún se desconoce si TCE01Cr3 es hipersensible, especialmente a la p53 R273H endógena, ya que la línea celular SW620 utilizada a lo largo de este estudio es heterocigota para TP53 R273H. Para determinar si la heterocigosidad contribuyó a esta sensibilidad, se empleó CRISPR/Cas9 para editar el exón 8 de p53, flanqueando a R273, con dos ARN guía y una plantilla de reparación que codifica la modificación 818819GT > AC (Figura S4A). Las células transfectadas con el plásmido que expresa Cas9 y los ARN guía se aislaron para su posterior evaluación (Figura S4B). Entre estas células, se observó la edición en aproximadamente el 12,27% de la población (Figura S4C). Las derivadas clonales se verificaron mediante PCR específica de la variante y la expresión de p21 (indicativo de la ablación del p53 de tipo salvaje) (Figuras S4D-S4F). Las líneas resultantes incluyeron p53 de tipo salvaje homocigoto y p53R273H compuesto heterocigoto (818G > A nativo más CRISPR 818819GT > AC). Las modificaciones se verificaron mediante secuenciación de Sanger, seguida de NGS que confirmó la modificación específica del objetivo y las ediciones no deseadas insignificantes (Figuras S4G y S4H). Cabe destacar que los clones homocigotos de p53R273H (818G > A o 818_819GT > AC) resultaron inviables para el cultivo sostenido (datos no mostrados), mientras que se obtuvo la línea celular heterocigota compuesta con dos alelos mutados diferentes que codifican la misma p53 R273H. Como resultado, en experimentos relacionados, utilizamos esta línea celular en paralelo con las líneas celulares homocigotas p53R273WT y heterocigotas p53R273H. En estos modelos endógenos, TCE01Cr3 logró un 47,81% de citotoxicidad a 3,9 × 10−2 nM en células p53R273H heterocigotas compuestas, en comparación con el 26,44% en heterocigotos. En comparación, TCE01C produjo un 26,82% y un 23,56%, respectivamente, a 4,0 nM. Se observó una actividad citotóxica insignificante en SW620 que expresaba HLA-C∗01:02 y que albergaba p53 de tipo salvaje homocigoto, así como en SW620 que expresaba HLA-A∗11:01 y que albergaba p53R273H (Figura 6G).

Además, evaluamos más a fondo la potencia de TCE01Cr3 en un panel de líneas celulares, incluidas las líneas celulares cancerosas SW620 (carcinoma colorrectal), NCI-H520 (cáncer de pulmón), MDA-MB-468 (carcinoma de mama) y PANC-1 (cáncer de páncreas), así como las líneas no cancerosas HEK293 (riñón embrionario humano) y CCL-75 WI-38 (fibroblastos pulmonares humanos). SW620 es heterocigota para TP53 R273H, MDA-MB-468 y PANC-1 son homocigotas para TP53 R273H, mientras que NCI-H520 es homocigota de tipo salvaje en este locus, similar a las células no malignas. Las células diana con el péptido p53 R273H endógeno se cocultivaron con TCE01Cr3 y células T a una relación E:T de 10:1 y se evaluó la viabilidad a 0, 24, 48 y 72 h. Observamos una citotoxicidad mediada por células T significativa en las tres líneas celulares cancerosas, aunque con diferente eficacia. La mayor actividad citotóxica se observó en las células MDA-MB-468 y PANC-1 que expresan HLA-C∗01:02 a las 48-72 h, seguida de SW620 en condiciones similares. En contraste, no se detectó una citotoxicidad significativa en las líneas celulares cancerosas que carecían de HLA-C∗01:02 ni en las líneas celulares HEK293 o WI-38 no cancerosas (Figura 6H).

Evaluación de la estabilidad de TCE dirigido a HLA-C∗01:02/p53 R273H

Investigamos más a fondo la estabilidad de TCE01Cr3. TCE01Cr3 emplea una arquitectura de cadena única (mini) truncada, en la que se omiten los dominios constantes del TCR, lo que puede influir no solo en la funcionalidad sino también en la estabilidad. Dado que el enfoque de cadena única estabilizada es relativamente nuevo en el campo, esta característica se consideró cuidadosamente en nuestros diseños.^[26] Estudios independientes han sugerido que el dominio Fc puede extender la vida media de las moléculas de compromiso de células T bispecíficas.^[22],^[35],^[63] Para determinar si este perfil de estabilidad es específico de la línea derivada de TCE01C o si es generalizable en diferentes formatos, cada una de las cuatro arquitecturas utilizadas en este estudio se administró por vía intravenosa a ratones Swiss y se evaluó la estabilidad midiendo las concentraciones séricas residuales durante 72 h mediante ELISA, con la vida media derivada mediante análisis no compartimental (Phoenix WinNonlin 8.5.2.4, Modelo 201) a partir de la fase de eliminación log-lineal terminal del perfil de concentración-tiempo de cada animal. Específicamente, TCE01Ar3 (plataforma A) y TCE01Br3 (plataforma B) conservan tanto las regiones variables como las constantes del TCR, mientras que TCE01Cr3 (plataforma C) y TCE01Dr.3 (plataforma D) emplean la arquitectura de cadena única truncada y estabilizada. Se compararon las concentraciones séricas de los cuatro formatos durante el mismo período de tiempo.

Nuestros resultados mostraron que TCE01Cr3 tuvo una vida media de 39,40 ± 10,50 h (Figura 7A; Tabla 1). Para determinar si la modificación de estabilización en sí misma afecta la estabilidad sistémica, comparamos TCE01Cr3 con los otros tres formatos y observamos vidas medias comparables en los cuatro (TCE01Ar3: 43,72 ± 10,71 h, N = 4; TCE01Br3: 48,12 ± 24,62 h, N = 6; TCE01Dr.3: 30,85 ± 16,36 h, N = 6) (Figuras 7A; Tabla S1), sin evidencia de que los formatos estabilizados (TCE01Cr3 y TCE01Dr.3) se eliminaran más rápido que sus contrapartes no estabilizadas (TCE01Ar3 y TCE01Br3). Estos datos indican que, dentro de este conjunto de formatos optimizados, la estrategia de estabilización no comprometió la estabilidad sistémica.

Para investigar más a fondo la estabilidad sérica de estos formatos in vitro, cada molécula se preincubó en suero humano a 37 °C durante 0-128 h. Después de la preincubación, las muestras se cocultivaron con células T primarias y células diana que expresan pHLA-C∗01:02 y que fueron tratadas con el péptido p53 R273H durante 24 h adicionales, y se evaluó la estabilidad indirectamente midiendo la liberación de IFN-γ como un indicador funcional. La preincubación prolongada condujo a una menor liberación de IFN-γ, particularmente en las muestras preincubadas durante más de 16 h.^[22] Para evaluar con precisión cómo los cambios en la estabilidad de TCE en el suero afectan la funcionalidad posterior, los niveles de IFN-γ se normalizaron a los valores obtenidos de las muestras de preincubación correspondientes de 0 h (definidas como 100% de actividad) con controles tratados con placebo establecidos en 0%. La actividad de TCE01Cr3 disminuyó en aproximadamente un 15% en la primera hora, seguida de una reducción adicional a una pérdida del 20-40% en 2-4 h y aproximadamente un 30% de pérdida en 8 h. Con una incubación prolongada, la tasa de disminución se ralentizó considerablemente, estabilizándose a las 128 h con un 20,43% de actividad residual. Los otros tres formatos mostraron un patrón de disminución general comparable durante el mismo período de tiempo (Figura 7B). Estos resultados indican que la estrategia de estabilización tuvo solo un impacto mínimo en la estabilidad sérica a largo plazo de TCE01Cr3, lo que es consistente con el perfil de los cuatro formatos comparable observado en la Figura 7A.

TCE01Cr3 derivado de ML requiere un refinamiento estructural tanto en las regiones CDR como no CDR

Aunque el mapeo in silico del complejo ternario de TCE01Cr3, B2M/HLA-C∗01:02 y p53R273H 9-mer H5 destacó la participación predominante de CDR, este no tuvo en cuenta las contribuciones a la conformación, como lo demuestran las distintas orientaciones espaciales entre TCE01C y TCE01Cr3 en relación con B2M/HLA-C∗01:02/p53R273H 9-mer H5 (Figuras S3B-S3E; Tabla S6). Además, para los candidatos optimizados, también notamos algunas mutaciones fuera de las regiones CDR y nos preguntamos cuánto contribuyen estos reemplazos a la actividad de las versiones optimizadas (Figura 4B). Para determinar si las modificaciones no CDR son esenciales para la unión y la funcionalidad de los TCE dirigidos a p53, generamos variantes híbridas intercambiando las regiones CDR y no CDR entre TCE01C y TCE01Cr3. Específicamente, el marco no CDR de TCE01Cr3 se integró en TCE01C para producir TCE01C-S, mientras que el marco no CDR de TCE01C se integró en TCE01Cr3 para producir TCE01Cr3-S (Figura S5A). La predicción de la estructura 3D in silico reveló una mayor similitud entre TCE01C-S y TCE01Cr3, y entre TCE01C y TCE01Cr3-S (Figuras S5B-S5E). Además, los análisis de respuesta a la dosis de la muerte celular y los ensayos de liberación de IFN-γ demostraron una eficacia reducida para TCE01C-S y TCE01Cr3-S en relación con la eficacia de TCE01Cr3, aunque ambos híbridos superaron a TCE01C (Figuras S5F y S5G). En particular, la eliminación de las regiones no CDR del TCR de TCE01Cr3 disminuyó notablemente la actividad de muerte, mientras que el injerto de estas regiones no CDR en TCE01C-S mejoró sustancialmente su potencia. Por otro lado, la especificidad se evaluó mediante el cocultivo con SW620 que expresaba HLA-C∗01:02 y que fue tratado con el péptido p53R273C 9-mer C5, con TCE01C-S y TCE01Cr3-S que mostraron un nivel intermedio de actividad no deseada (Figura S5H). Estos hallazgos sugieren en conjunto que las optimizaciones limitadas a las regiones CDR o no CDR son insuficientes para mejorar completamente la actividad y la especificidad de los TCE derivados de ML, lo que requiere modificaciones coordinadas en ambas regiones.

En particular, dado que TCE01C es sensible a HLA-C∗01:02/p53R273C 9-mer C5, aplicamos un enfoque y criterios análogos dirigidos por ML para desarrollar TCE04C con una sensibilidad y especificidad mejoradas para este objetivo (Figura S5I). TCE04C exhibió una mayor citotoxicidad y especificidad hacia HLA-C∗01:02/p53R273C (Figuras S5J y S5K), lo que justifica una mayor investigación en estudios posteriores.

Las variantes optimizadas de TCE inducen una potente citotoxicidad mediada por células T en esferoides de tumores multicelulares 3D

Para evaluar la eficacia antitumoral de las variantes optimizadas de TCE en entornos de tumores 3D complejos, se ensamblaron esferoides multicelulares que comprendían células de CRC que expresaban HLA-C∗01:02 y que fueron tratadas con el péptido p53R273H 9-mer H5 (fluorescencia verde), células endoteliales del cordón umbilical humano (HUVEC; rojo) y células madre derivadas del tejido adiposo (ASC; azul). Los esferoides se trataron luego con TCE01Cr3 en presencia o ausencia de células T primarias, ya sea solas o en combinación con agentes quimioterapéuticos (oxaliplatino o irinotecán) y se monitorearon mediante microscopía de campo claro y fluorescencia a 0, 24 y 48 h. La viabilidad de las células cancerosas que expresan HLA-C∗01:02 y que fueron tratadas con el péptido p53 R273H, las HUVEC no cancerosas y las ASC se evaluó mediante cambios en la señal de fluorescencia verde, roja y azul a lo largo del tiempo de incubación. TCE01Cr3 indujo una desintegración progresiva y una pérdida de fluorescencia verde en condiciones que contenían células T, lo que indica la lisis dirigida de la CRC. El cotratamiento con oxaliplatino o irinotecán no aumentó este efecto, y los controles que carecían de TCE o células T conservaron la integridad del esferoide (Figura 7C). TCE01Cr3 indujo una lisis de esferoides mediada por células T dependiente de la dosis, con una eficacia superior cuando se usó solo en comparación con las combinaciones con oxaliplatino o irinotecán, mientras que las condiciones sin TCE ni células T permanecieron en la línea de base (Figura 7D). La secreción de IFN-γ reflejó estas tendencias, con TCE01Cr3 y TCE01Cr3/oxaliplatino que produjeron máximos de aproximadamente 8,42 ng/mL, pero con diferentes valores de CE50 (0,051 y 0,49 nM, respectivamente), seguidos de TCE01Cr3/irinotecán (aproximadamente 5,24 ng/mL, CE50 = 3,3 nM) (Figura 7E).

Los esferoides que albergaban células de CRC con mutaciones p53R273H endógenas (homocigotas o heterocigotas) se evaluaron de manera similar hasta 72 h. TCE01Cr3 indujo una rápida disrupción del esferoide y una pérdida de fluorescencia de células vivas en esferoides de CRC heterocigotos compuestos (R273H/R273H), con efectos intermedios en esferoides heterocigotos (R273H/R273WT); el TCE01C parental mostró solo una actividad débil (Figura 7F). Las curvas de respuesta a la dosis revelaron una mayor potencia contra los objetivos homocigotos (79,85% de lisis máxima, CE50 ≈ 2,3 nM) que contra los objetivos heterocigotos (54,32% de lisis máxima, CE50 ≈ 8,2 nM), lo que subraya la sólida eficacia de la variante derivada de ML (Figura 7G). Estos hallazgos destacan la fuerte eficacia independiente de la quimioterapia de la variante optimizada en un modelo tumoral endógeno 3D.

Discusión

Describimos el desarrollo, la optimización y la caracterización funcional de un receptor bispecífico de unión a células T (TCE) que se dirige al neoantígeno recurrente p53R273H presentado por HLA-C∗01:02. A partir de un TCR aislado de un paciente con cáncer colorrectal cuyas células T habían sido expuestas al péptido p53 R273H de 25 aminoácidos, generamos un panel de constructos TCE y evaluamos sistemáticamente sus requisitos de presentación antigénica, cinética de unión, especificidad, potencia y actividad tanto en modelos tumorales 2D como 3D in vitro.

Un hallazgo clave fue la presentación altamente específica del alelo del epítopo p53R273H. De los seis alelos de clase I HLA del paciente, solo HLA-C∗01:02 presentó de manera eficiente el péptido inmunodominante de 9 aminoácidos (SFEVHVCAC), lo que resultó en una citotoxicidad robusta dependiente de las células T. Esta selectividad explica las respuestas clínicas inconsistentes observadas con las terapias dirigidas a p53 y destaca la necesidad de la genotipificación HLA para la estratificación de pacientes.

La conversión del TCR en un formato de cadena única unida (miniTCE) redujo el peso molecular en aproximadamente un 24%, al tiempo que se preservó la afinidad de unión a pHLA-C∗01:02/p53R273H y se mejoró significativamente la potencia citotóxica, la activación de las células T y la liberación de citocinas en comparación con los formatos de cadena completa. El enfoque de unión, adaptado de las innovaciones recientes en la estabilización de scFv, introduce enlaces disulfuro mediante sustituciones de cisteína dirigidas (por ejemplo, M43C en la cadena β y A100C en la cadena α) y un enlazador similar a una bisagra, lo que promueve el emparejamiento adecuado de las cadenas y la integridad conformacional fuera de las regiones CDR. Esto no solo mitiga los riesgos de agregación asociados con los constructos de cadena única tradicionales, sino que también mejora la estabilidad sérica, como lo demuestra la inducción sostenida de IFN-γ después de una preincubación prolongada. Estas mejoras podrían extender la vida media y la biodisponibilidad in vivo, abordando una limitación común de los agentes bispecíficos.

La afinidad de unión a pHLA del TCR01, medida dentro del andamio TCE01, supera el rango que se informa habitualmente para la interacción natural TCR-pHLA (1-100 μM). Esto probablemente refleja tanto la estrategia de selección funcional utilizada para aislar TCR01, que enriqueció para los clones con mayor avidez relativa para pHLA-C∗01:02/p53R273H en función de la respuesta de IFN-γ, lo que es consistente con la maduración de la avidez durante la selección clonal de células T impulsada por el antígeno, y la tetramerización basada en estreptavidina del ligando pHLA inmovilizado en el ensayo BLI, lo que puede promover la re-unión del analito y producir afinidades aparentes más altas que la interacción monomérica real. Estudios previos han demostrado que los TCE monovalentes que incorporan TCR con afinidad fisiológica (rango de μM) no logran provocar una citotoxicidad robusta mediada por las células T, lo que requiere TCR diseñados para mejorar la afinidad o anticuerpos que imitan al TCR para un diseño eficaz, como lo ejemplifica tebentafusp (ImmTAC), que combina un TCR con afinidad mejorada con un scFv anti-CD3, y nuestros TCE dirigidos a KRASG12V previamente informados, donde la incorporación de TCR de alta afinidad también fue necesaria para una potente activación y citotoxicidad de las células T. La afinidad naturalmente elevada de TCR01, que surge de la selección funcional de reactividad al neoantígeno en lugar de una ingeniería deliberada, es, por lo tanto, consistente con, y probablemente necesaria para, la potente actividad monovalente del TCE observada en este estudio. Basándonos en esta favorable afinidad inicial, buscamos a continuación refinar aún más la especificidad y la potencia mediante una ingeniería guiada por la estructura.

La evolución dirigida posterior, guiada por el aprendizaje automático, produjo la molécula líder TCE01Cr3, que exhibió una afinidad notablemente mejorada (Kd = 2,51 nM), una potencia excepcional (CE50 ≈ 10-5 nM) y una especificidad mejorada en relación con el TCE parental TCE01C. Aprovechando herramientas como EvoPro, EvoProtGrad y Antibody Evol sobre estructuras pMHC-TCR predichas (de AlphaFold 3, Boltz-2, etc.), el proceso iterativo refinó los residuos no CDR para optimizar la unión a la hendidura y la alineación de las cadenas, amplificando las interacciones CDR3 con el péptido al tiempo que reforzaba los contactos HLA. Además, el TCE parental con reactividad cruzada TCE01C se puede diseñar sistemáticamente en candidatos altamente específicos como TCE01Cr3 para TP53 R273H o TCE04C para TP53 R273C con una sensibilidad y eficacia sustancialmente mejoradas. Esta estrategia impulsada por el aprendizaje automático ejemplifica cómo el diseño computacional de proteínas puede acelerar la maduración de la afinidad y el ajuste de la especificidad, reduciendo las responsabilidades fuera del objetivo en una fracción del tiempo necesario para el cribado empírico de bibliotecas.

La mutagénesis de escaneo de alanina y el modelado de AlphaFold 3/Boltz-2 identificaron los segundo y cuarto residuos del péptido de 9 aminoácidos como anclajes críticos tanto para la unión a HLA-C∗01:02 como para el reconocimiento de TCE01C, lo que proporciona una justificación estructural para su perfil de selectividad. Además, la mutagénesis de escaneo posicional en los residuos clave, combinada con ensayos funcionales basados en células (Figuras 6A-6E), proporciona una comprensión más profunda de los perfiles de especificidad de estos TCE diseñados. En general, TCE01C mostró una amplia tolerancia a las sustituciones conservadoras, acomodando péptidos en los que los aminoácidos con propiedades fisicoquímicas similares reemplazaron los residuos originales en las posiciones correspondientes dentro del epítopo H5 de p53R273H de 9 aminoácidos (SFEVHVCAC). En contraste, el TCE optimizado TCE01Cr3 exhibió una mayor rigurosidad, mostrando una fuerte selectividad incluso para las sustituciones con características fisicoquímicas similares, mejorando así la especificidad general al tiempo que se mantiene una potente toxicidad. TCE01Cr3 representa, por lo tanto, un avance significativo en la focalización de p53R273H, una mutación de punto caliente que impulsa la oncogénesis en diversos cánceres. Al lograr una exquisita especificidad para el epítopo mutante con una reactividad cruzada mínima con el p53 de tipo salvaje u homólogos, mitiga los riesgos de autoinmunidad al tiempo que mantiene una amplia aplicabilidad como un agente listo para usar para pacientes positivos para HLA-C∗01:02. Su rendimiento superior contra el p53R273H endógeno en modelos heterocigotos, heterocigotos compuestos y homocigotos mutantes, al tiempo que mantiene una actividad mínima en los modelos de tipo salvaje, subraya su potencial para abordar la heterogeneidad tumoral.

No obstante, se deben reconocer varias limitaciones. El enfoque de escaneo posicional en este estudio se centró principalmente en cuatro posiciones clave (F2, H5, V6 y A8) dentro del epítopo de 9 aminoácidos. Si bien esto proporcionó información crítica sobre las interacciones TCR-pHLA, una biblioteca de mutagénesis combinatoria más completa en todas las posiciones del epítopo, combinada con un análisis estructural más profundo (por ejemplo, criomicroscopía electrónica o cristalografía de alta resolución del complejo ternario), refinaría aún más las predicciones de especificidad e identificaría residuos adicionales tolerados o intolerantes. Además, la validación en etapa inicial durante la evaluación del TCE se basó en modelos de ingeniería HLA con péptidos. Si bien este enfoque permite una evaluación rápida de la eficacia y la especificidad del TCE, no recapitula completamente las condiciones fisiológicas, en las que los neoantígenos procesados endógenamente se presentan en densidades sustancialmente más bajas en la superficie celular. Aunque evaluamos la actividad de TCE01Cr3 contra células que albergan mutaciones TP53 R273H endógenas tanto en modelos 2D como 3D de esferoides, persisten las limitaciones con respecto a la eficacia, la durabilidad y la frecuencia de las muestras de pacientes que coexpresan HLA-C∗01:02 y la mutación TP53 R273H. Se requerirán estudios futuros para evaluar aún más la sensibilidad y la ventana terapéutica de TCE01Cr3 en estas condiciones más clínicamente relevantes.

Es importante destacar que TCE01Cr3 mantuvo una alta eficacia en esferoides multicelulares 3D que contenían células de CRC, células HUVEC y células madre derivadas del tejido adiposo, logrando >80% de eliminación de las células tumorales que expresaban p53R273H con péptidos y endógenas en 48 horas, al tiempo que se preservaba el estroma no maligno. Sorprendentemente, TCE01Cr3 como monoterapia indujo una desintegración de esferoides más rápida y extensa y una mayor lisis específica máxima que las combinaciones con oxaliplatino o irinotecán en el modelo 3D. Este rendimiento superior en un entorno fisiológicamente relevante plantea la posibilidad de que las moléculas TCE con afinidad madurada que se dirigen a neoantígenos recurrentes como p53R273H puedan lograr un beneficio clínico significativo sin la necesidad de quimioterapia combinada, reduciendo así el riesgo de toxicidades superpuestas y mejorando la tolerabilidad en los pacientes. TCE01Cr3 mostró un margen de seguridad medible contra el p53 de tipo salvaje o R273C. En los ensayos de titulación de dosis de péptidos (Figura 5F), la citotoxicidad mediada por R273H alcanzó su máximo a concentraciones de péptidos tan bajas como ∼2 nM, mientras que la muerte detectable contra los péptidos mutantes de tipo salvaje R273 o R273C requirió una concentración ∼10 000 veces mayor (20 000 nM) y se mantuvo cerca de la línea de base en todas las dosis más bajas probadas. Debido a que la carga de pulsación de péptidos carga las moléculas HLA muy por encima de la densidad que se logra mediante el procesamiento de antígenos endógenos, la dosis de 20 μM utilizada para el cribado de especificidad se eligió deliberadamente para exceder la presentación de neoantígenos fisiológicos. Este margen in vitro probablemente subestima la verdadera separación entre el umbral de activación mutante y la densidad mucho menor del péptido de p53 de tipo salvaje que se presenta naturalmente en los tejidos normales. Sin embargo, esto sigue siendo una estimación derivada de un sistema sustituto con péptidos, en lugar de una medición directa de la presentación endógena de p53 de tipo salvaje en las células normales, y debe confirmarse con inmunopeptidómica HLA o modelos in vivo humanizados antes de la traducción clínica. La molécula también exhibió una buena estabilidad del suero del ratón durante casi 40 horas, lo que respalda su idoneidad para la administración sistémica.

Implicaciones clínicas

TCE01Cr3 promete una oncología de precisión en los cánceres con mutaciones de p53, donde las mutaciones afectan a más del 50% de las neoplasias (por ejemplo, colorrectal, pulmón, mama, ovario). La focalización del neoantígeno frecuente R273H a través de HLA-C∗01:02 (∼5-10% de prevalencia global, mayor en las poblaciones asiáticas/europeas) permite la estratificación de pacientes mediante la tipificación HLA y el secuenciamiento tumoral, ampliando el acceso al tiempo que se evitan tratamientos inútiles.

Su formato listo para usar evita los retrasos de la terapia autóloga, lo que lo hace ideal para los casos recurrentes/recalcitrantes con resistencia a la quimioterapia impulsada por p53. La potencia nanomolar y la preservación del estroma en los modelos 3D implican una fuerte penetración tumoral. También apuntan a una ventana de seguridad favorable: la muerte se estabilizó a ∼2 nM de péptido mutante, pero requirió ∼10 000 veces más péptido de tipo salvaje (20 000 nM) antes de que apareciera alguna actividad (Figura 5F). Esta es una estimación temprana in vitro de la ventana terapéutica contra la toxicidad fuera del objetivo en tumores sólidos heterogéneos, no una garantía de seguridad clínica. Debe confirmarse midiendo la densidad real de presentación de p53 de tipo salvaje en los tejidos normales y probando la tolerabilidad in vivo. La ausencia de beneficio adicional de oxaliplatino o irinotecán indica que el TCE puede lograr una eficacia antitumoral robusta como agente único, lo que podría evitar la necesidad de quimioterapia concomitante y, por lo tanto, evitar las toxicidades asociadas con la quimioterapia en los pacientes.

Los paradigmas de "stapling" y ML mejoran la estabilidad biofísica, la dosificación y la eficiencia del proceso para las terapias neoantigénicas. Es importante destacar que, si bien este estudio ha investigado exhaustivamente la eficacia, la sensibilidad y el perfil de especificidad de TCE01Cr3 tanto en modelos 2D como 3D, no hemos caracterizado su rendimiento en modelos animales. El sistema de esferoides 3D es más complejo desde el punto de vista fisiológico que el cocultivo 2D estándar, pero no puede sustituir por completo a un microambiente tumoral intacto, como los organoides derivados del paciente o los modelos de "órgano en un chip". Por lo tanto, hemos diseñado dos estudios complementarios utilizando xenoinjertos en ratones NOD o NOG, utilizando el modelo SW620 positivo para HLA-C∗01:02/p53R273H con células efectoras PBMC humanas: (1) un diseño de inicio temprano en el que las células tumorales y las PBMC/células T se co-injertan subcutáneamente y se administra una única dosis intravenosa de 0,2, 1,0 o 5 mg/kg frente a los controles, con el seguimiento de la supervivencia, el peso corporal y la inhibición del crecimiento tumoral a lo largo del tiempo, y (2) un diseño de tumor establecido, en el que los tumores se cultivan durante 10 días con infusión de PBMC humanas en el día 3, y luego se administra una única dosis terapéutica de TCE01Cr3 (1 mg/kg) en el día 10, evaluando la supervivencia, la regresión tumoral y la infiltración de células T. El riesgo del síndrome de liberación de citoquinas, la biodistribución y la inmunogenicidad requerirán estudios de seguimiento específicos. Además, la eficacia de TCE01Cr3 sobre el neoantígeno p53 R273H presentado de forma endógena no logró la máxima citotoxicidad, lo que sugiere la posible necesidad de combinarlo con otros tratamientos dirigidos a la mutación p53. No obstante, estos resultados colectivos establecen a TCE01Cr3 como un candidato prometedor "listo para usar" para pacientes cuyos tumores albergan la mutación "hotspot" p53R273H y el alelo HLA-C∗01:02.

Implicaciones clínicas

TCE01Cr3 promete ser una herramienta valiosa en la oncología de precisión para los cánceres con mutaciones en p53, donde las mutaciones afectan a más del 50% de las neoplasias (por ejemplo, colorrectal, pulmón, mama, ovario). El tratamiento del neoantígeno R273H frecuente a través de HLA-C∗01:02 (∼5–10% de prevalencia global, mayor en poblaciones asiáticas/europeas) permite la estratificación de pacientes mediante la tipificación HLA y la secuenciación tumoral, ampliando el acceso y evitando tratamientos inútiles.

Su formato "listo para usar" evita los retrasos de la terapia autóloga, lo que lo hace ideal para casos recurrentes/refráctarios con quimiorresistencia impulsada por p53. La potencia nanomolar y la preservación del estroma en modelos 3D implican una fuerte penetración tumoral. También sugieren una ventana de seguridad favorable: la citotoxicidad se estabilizó en aproximadamente 2 nM del péptido mutante, pero se necesitaron aproximadamente 10.000 veces más péptido de tipo salvaje (20.000 nM) antes de que apareciera alguna actividad (Figura 5F). Esta es una estimación temprana in vitro de la ventana terapéutica contra la toxicidad "on-target/off-tumor" en tumores sólidos heterogéneos, no una garantía de seguridad clínica. Debe confirmarse midiendo la densidad real de presentación de p53 de tipo salvaje en los tejidos normales y probando la tolerabilidad in vivo. La ausencia de beneficios adicionales de oxaliplatino o irinotecán indica que TCE puede lograr una eficacia antitumoral robusta como agente único, lo que podría eliminar la necesidad de quimioterapia concomitante y, por lo tanto, evitar las toxicidades asociadas a la quimioterapia en los pacientes.

Los paradigmas de "stapling" y ML mejoran la estabilidad biofísica, la dosificación y la eficiencia del proceso para las terapias neoantigénicas. Es importante destacar que, si bien este estudio ha investigado exhaustivamente la eficacia, la sensibilidad y el perfil de especificidad de TCE01Cr3 tanto en modelos 2D como 3D, no hemos caracterizado su rendimiento en modelos animales. El sistema de esferoides 3D es más complejo desde el punto de vista fisiológico que el cocultivo 2D estándar, pero no puede sustituir por completo a un microambiente tumoral intacto, como los organoides derivados del paciente o los modelos de "órgano en un chip". Por lo tanto, hemos diseñado dos estudios complementarios utilizando xenoinjertos en ratones NOD o NOG, utilizando el modelo SW620 positivo para HLA-C∗01:02/p53R273H con células efectoras PBMC humanas: (1) un diseño de inicio temprano en el que las células tumorales y las PBMC/células T se co-injertan subcutáneamente y se administra una única dosis intravenosa de 0,2, 1,0 o 5 mg/kg frente a los controles, con el seguimiento de la supervivencia, el peso corporal y la inhibición del crecimiento tumoral a lo largo del tiempo, y (2) un diseño de tumor establecido, en el que los tumores se cultivan durante 10 días con infusión de PBMC humanas en el día 3, y luego se administra una única dosis terapéutica de TCE01Cr3 (1 mg/kg) en el día 10, evaluando la supervivencia, la regresión tumoral y la infiltración de células T. El riesgo del síndrome de liberación de citoquinas, la biodistribución y la inmunogenicidad requerirán estudios de seguimiento específicos. Además, la eficacia de TCE01Cr3 sobre el neoantígeno p53 R273H presentado de forma endógena no logró la máxima citotoxicidad, lo que sugiere la posible necesidad de combinarlo con otros tratamientos dirigidos a la mutación p53. No obstante, estos resultados colectivos establecen a TCE01Cr3 como un candidato prometedor "listo para usar" para pacientes cuyos tumores albergan la mutación "hotspot" p53R273H y el alelo HLA-C∗01:02.

Materiales y métodos

Declaración ética

Las muestras de sangre humana se recogieron para fines de investigación de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de Ética del Instituto de Genética Médica (número de aprobación 02/2024/CT-VDTYH) y se llevaron a cabo de acuerdo con los principios éticos de la Declaración de Helsinki (1964). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de cada participante de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Todos los procedimientos cumplieron con las directrices y regulaciones, y la recolección de muestras se realizó en el Instituto de Genética Médica.

Ingeniería de TCE, clonación y construcción de plásmidos

Para las secuencias de las variantes de TCE utilizadas en este estudio, consulte la Tabla S7. Los plásmidos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla S8. Los plásmidos originales se obtuvieron de BioIntron (pcDNA 3.4 (+)), Takara Bio (pLVX Puro 632164), Invitrogen (plásmido de nucleasa CRISPR GeneArt OFP A21174) e Invitrogen (pcDNA 3.1 (+) V79020). Todos los constructos se diseñaron internamente y se ensamblaron utilizando el clonado de Gibson (Tabla S8). Los fragmentos de TCE o HLA se amplificaron utilizando la ADN polimerasa Q5 High Fidelity (NEB M0491S) o la ADN polimerasa GXL (Takara R050A), seguida de un tratamiento con DpnI (NEB R0176L) y una purificación de PCR basada en isopropanol. Estos fragmentos se insertaron luego en los vectores de pcDNA 3.4 (+) (para las estructuras de TCE) o pLVX (para los plásmidos que expresan lentivirus) mediante el ensamblaje de Gibson (Thermo Fisher A46628) siguiendo el procedimiento estándar. Los fragmentos ensamblados se transformaron en células competentes 10-beta (NEB C3019I) para los plásmidos de TCE o Stbl3 (Thermo Fisher C737303) para los plásmidos de lentivirus. Los plásmidos se verificaron mediante secuenciación de Sanger en DNA Sequencing Vietnam.

Producción y purificación de TCE

Los TCE se produjeron y purificaron internamente. Todos los TCE se generaron en células HEK293T, utilizando polietilenimina (PEI) de 10 kDa (Sigma-Aldrich 765090) o Lipofectamine 3000 (Invitrogen L3000015) en medio OptiMEM (Gibco 11058521) a 37 °C y 5 % de CO2 durante 4 a 7 días. La expresión se evaluó antes de la purificación mediante un ensayo de "dot-blot" o SDS-PAGE con tinción con plata o ELISA utilizando anti-IgG humana (Fc específico)-HRP.

La purificación interna se realizó utilizando un sistema ÄKTA (Cytiva) con una columna HiTrap MabSelect PrismA (Cytiva 17549853) siguiendo las recomendaciones del fabricante con algunos ajustes, donde la columna se sometió a una disminución gradual del pH del citrato de 7,2 a 3,5. Las fracciones se evaluaron mediante SDS-PAGE al 8-10 % con tinción con plata y los monómeros se purificaron aún más mediante cromatografía de exclusión por tamaño. Las fracciones de alto rendimiento y alta pureza se combinaron y se intercambiaron a un tampón de almacenamiento (0,55 mg/mL de ácido glutámico, 0,03 mg/mL de polisorbato 80, 28,5 mg/mL de sacarosa; pH 5,2).

Líneas celulares y cultivo

Todas las líneas celulares se mantuvieron a 37 °C con 5 % de CO2. Las células de riñón embrionario humano para la producción de lentivirus (HEK293T, Takara Bio 632273), las células de carcinoma colorrectal (SW620 y ATCC CCL-227), las células de carcinoma pulmonar (NCI-H520 y ATCC HTB-182), las células de cáncer de mama (MDA-MB-468 y ATCC HTB-132), las células de cáncer de páncreas (PANC-1 y ATCC CRL-1469), las células madre derivadas del tejido adiposo humano (ASC), las células de fibroblastos pulmonares (CCL-75 WI-38) se adaptaron y cultivaron en DMEM (Thermo Fisher 11995081) suplementado con 10 % de suero fetal bovino (SFB) inactivado por calor (Thermo Fisher A5256701). Las células revividas de los bancos crioconservados se expandieron durante 3-4 pasajes antes de su uso.

Recolección de PBMC y aislamiento de células T

Las PBMC se aislaron de muestras de sangre de donantes utilizando Lymphoprep (Stemcell Technologies 07861) según el protocolo del fabricante con modificaciones menores. Brevemente, la sangre diluida se colocó en capas sobre Lymphoprep y se centrifugó a 1000 × g durante 30 minutos a temperatura ambiente con aceleración y freno desactivados. Las PBMC se congelaron inmediatamente para su almacenamiento o se sometieron a aislamiento de células T en un plazo máximo de 2 días.

Las células CD3+ T se aislaron de las PBMC utilizando el kit de aislamiento de células T humanas EasySep (Stemcell Technologies 17951) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los linfocitos se resuspendieron a 5 × 107 células/mL y se incubaron con el cóctel de aislamiento (50 μL/mL) durante 5 minutos a temperatura ambiente, seguido de la adición de RapidSpheres (50 μL/mL). La mezcla se completó hasta 2,5 mL con medio de lavado (PBS que contiene 2 % de SFB y 1 mM de EDTA, sin Ca2+/Mg2+). Las células CD3+ se capturaron magnéticamente y las células CD3+ T en el sobrenadante se recogieron y se resuspendieron en medio AIM-V.

Transfección transitoria de células en cultivo

Para la transfección mediada por PEI, las células se cultivaron en medio sin antibióticos, se lavaron brevemente con 1 × PBS precalentado (Cytiva SH30258.02) y se cultivaron en un volumen del 80 % de Opti-MEM (Thermo Fisher 11058021). El ADN del plásmido se complejó con PEI (10 kDa; Sigma-Aldrich 765090) en una relación de 1:3 (p/p) en Opti-MEM durante 20-25 minutos a temperatura ambiente o 37 °C y se añadió por goteo a las células. Para la transfección mediada por Lipofectamine 3000, los plásmidos se prepararon según el protocolo del fabricante (Thermo Fisher L3000015) y se incubaron con las células durante 6 horas antes de reemplazarlos con medio completo fresco.

Producción y transducción de lentivirus

Las células HEK293T (número de pasaje 95%. Los péptidos se resuspendieron en el disolvente adecuado siguiendo el certificado de análisis del fabricante (CoA) a una concentración de 20 mM y se almacenaron en alícuotas a −80 °C. Cada lote de péptidos se sometió a un máximo de dos ciclos de congelación-descongelación.

Pulsación con péptidos y cocultivo

Para la pulsación con péptidos, las células NCI-H520, MDA-MB-468 y SW620 que expresan el alelo HLA de interés se sembraron a una densidad de 6,25 × 104 células por cm2 en un medio AIM-V suplementado con 0-2% de FBS y los péptidos relevantes a las concentraciones indicadas. Las células se incubaron durante 18-24 h a 37 °C bajo 5% de CO2. Las células pulsadas se lavaron una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y una vez con medio AIM-V suplementado con 5% de FBS, se resuspendieron y se sembraron a una densidad de 2 × 105 células por ml.

Para los experimentos de cocultivo, las células efectoras (PBMC o células T) se expandieron en un medio AIM-V suplementado con 5% de FBS y luego se mezclaron con las células diana a las proporciones efector:diana (E:T) especificadas en presencia de receptores de unión a células T (TCE) relevantes. Los cocultivos se mantuvieron durante 24-48 h antes del análisis posterior.

Citometría de flujo y tinción celular

Para obtener una lista completa de los anticuerpos utilizados en este estudio, consulte la Tabla S9. Para la tinción de la superficie celular, las células se lavaron tres veces en PBS frío 1×, se resuspendieron en PBS frío 1× y se incubaron con anticuerpos conjugados con fluoróforos durante 30 min a 4 °C en la oscuridad. Las células se lavaron tres veces en PBS frío 1× antes del análisis. Para la tinción intracelular de perforina y granzima B, las células T se incubaron con el inhibidor del transporte de proteínas monensina (eBioscience, n.º de catálogo 00-4505-51) durante 4-6 h a 37 °C bajo 5% de CO2. Luego, las células se permeabilizaron utilizando el tampón de lavado de permeabilización para tinción intracelular (BioLegend, n.º de catálogo 421002) durante 45 min, se lavaron dos veces y se tiñeron con los anticuerpos relevantes. Los datos de citometría de flujo se adquirieron en un citómetro de flujo Agilent NovoCyte.

Estrategia de clasificación: Las células singlete se identificaron utilizando los parámetros de dispersión directa (FSC) y dispersión lateral (SSC). Después de la clasificación de singletes, las células vivas de interés se definieron utilizando marcadores específicos (CD3-PE-Cy7 para las células T y His-APC para las células SW620). Los marcadores de la activación de las células T y la producción de gránulos citotóxicos se evaluaron midiendo CD69-APC, perforina-AF700 y granzima B-PerCP, con comparaciones entre las muestras tratadas con placebo y las muestras experimentales en las condiciones indicadas.

Ensayo de unión a nivel celular

Para los ensayos de unión celular, las células diana se incubaron con los TCE relevantes durante 1 h en un medio definido y luego se procedió con un anticuerpo secundario para la evaluación mediante citometría de flujo.

Ensayos funcionales a nivel celular

Las células pulsadas con péptidos se lavaron una vez en 1× PBS y una vez en AIM-V que contiene 2% de FBS. Las células efectoras se cultivaron en un medio AIM-V suplementado con 2% durante al menos 24 h y se comprobó su viabilidad. Luego, las células se cocultivaron con las células efectoras en presencia de los TCE relevantes. El sobrenadante se recogió para el ensayo de liberación de IFN-γ mediante ELISA (Biolegend 430104). Simultáneamente, las células T se recogieron para los ensayos de activación de las células T, como se describió anteriormente, y las células diana se sometieron a un ensayo de citotoxicidad basado en la luminiscencia utilizando Celltiter-Glo (Promega G9242). Ambos ensayos funcionales se realizaron siguiendo las instrucciones del fabricante.

Evaluación in silico de péptidos y predicción de complejos proteicos

La identificación de homólogos de péptidos se realizó utilizando NCBI Blast y Expasy ProScan con la base de datos de proteínas UniProt para Homo sapiens, utilizando un corte de 4 desajustes. Los péptidos homólogos y los péptidos escaneados con alanina se evaluaron con el péptido H5 de p53R273H de 9 aminoácidos para la afinidad de unión con HLA-C∗01:02 utilizando NetMHC Pan 4.1 o la predicción de MHC-I. Los modelos de unión de los TCE con p53R273H/HLA-C∗01:02 y CD3 se realizaron utilizando una combinación de Python-scripted Alphafold 3.0, TCR model 2.3, Boltz-2 y TCR dock. PyMOL se utilizó para evaluar y optimizar la visualización de los modelos.

Evolución dirigida basada en el aprendizaje automático

En resumen, se generó un complejo entre B2M, HLA-C∗01:02 y el péptido p53 R273H mediante Boltz-2, Alphafold 3.0 y el modelo TCR para garantizar la coherencia de la predicción de la estructura. Luego, se añadió el TCE parental al complejo de pHLA y se generó una nueva estructura espacial del complejo, que se evaluó en los tres modelos anteriores. Este complejo se sometió a una evolución dirigida in silico mediante EvoPro, EvoProtGrad con un máximo de 50 mutaciones por ronda y 20 ciclos de optimización por ejecución, centrándose en la región TCR del TCE, mientras que la anti-CD3, la Fc del TCE y el pHLA permanecieron sin cambios. Por cada ronda de evolución dirigida, se seleccionaron los 10 mejores candidatos de TCE con menor energía libre (ΔG) y menor energía libre de unión (ddG) para una evaluación posterior, que incluyó la afinidad de unión, la estabilidad y la agregación utilizando programas computacionales independientes. Por ejemplo, se probaron estos candidatos para la afinidad de unión con HLA y el péptido presentado a 25 °C y 37 °C mediante PRODIGY. La puntuación de agregación se evaluó evaluando la distribución de residuos hidrofóbicos e hidrofílicos a lo largo de las secuencias TCR utilizando Aggrescan 3D y DeepSP. Además, también se evaluó el potencial de inmunogenicidad de los candidatos utilizando ABImmpred y Hu-mAb. Se eligió el mejor candidato por ronda entre los mejores resultados de cada categoría y se utilizó como constructo de partida para la siguiente ronda de evolución dirigida.

Formación de esferoides y administración de fármacos

Para evaluar los efectos citotóxicos de los activadores de células T (TCE) solos y en combinación con la quimioterapia, se generaron esferoides de cáncer colorrectal (CRC) en 3D. Se utilizaron oxaliplatino (MedChem Express, HY-17371) e irinotecán (MedChem Express, HY-16562) como agentes quimioterapéuticos junto con los TCE. Los esferoides se crearon cocultivando células SW620 de CRC (ATCC, CCL-227), células endoteliales del cordón umbilical humano (HUVEC) y células estromales derivadas de tejido adiposo humano (ASC, Cellosaurus CVCL_4W37) en una proporción de 3:1:1, con un total de 6.000 células, en placas de fondo redondo de ultra bajo agarre de 96 pocillos (Corning Costar, 7007). Las células se suspendieron en 200 μL de medio AIM-V (Gibco, 12055091) suplementado con 5% de FBS (Gibco, 10437028) y, ya sea con la presencia de 2 μM o la ausencia del péptido p53R273H de 9 aminoácidos H5 para promover la presentación del antígeno específico de TCE en las células SW620 en modelos pulsados o endógenos. Las células SW620 y las ASC se transfectaron de forma estable con proteína fluorescente verde (GFP) y proteína fluorescente roja (RFP), respectivamente, para permitir la visualización de las interacciones tumor-estromales. Las placas se centrifugaron a 350 × g durante 5 min y se incubaron a 37 °C con 5% de CO2 durante 48 h para formar esferoides compactos.

Los esferoides se cocultivaron con 1 × 105 células T y se expusieron a agentes únicos (TCE01C, TCE01Cr3, oxaliplatino o irinotecán) o sus combinaciones. Para los tratamientos únicos con TCE, los TCE01C y TCE01Cr3 se diluyeron 4 veces en un rango de 10 puntos (0,015-60 nM). Para los tratamientos únicos con quimioterapia, el oxaliplatino (0,2-200 μM) y el irinotecán (0,1-100 μM) se diluyeron 10 veces. En los estudios de combinación, los TCE (0,00015-60 μM) se combinaron con dosis subletales fijas de oxaliplatino (10 μM) o irinotecán (100 μM). Los controles consistieron en esferoides solos, esferoides con células T, células T solas y células T con oxaliplatino o irinotecán. Después de 48 h, se evaluó la morfología del esferoide y la fluorescencia de la GFP utilizando un sistema de imagen EVOS M5000 (Thermo Fisher Scientific). La intensidad de la fluorescencia de la GFP se cuantificó con el software ImageJ (NIH, v1.53). Los sobrenadantes se recogieron para la medición de IFN-γ mediante un ensayo de ELISA, como se describió anteriormente.^[22]

Análisis estadístico

La citotoxicidad mediada por las células T se evaluó utilizando el ensayo Celltiter-Glo, en el que la cantidad de ATP de las células vivas se utilizó para determinar la densidad de células vivas. El porcentaje de lisis celular específica se calculó utilizando la siguiente ecuación ^[1]:

Para el ensayo de liberación de IFN-γ mediante ELISA, los resultados se normalizaron con respecto a las muestras de cocultivo sin TCE. Las señales de citometría de flujo se normalizaron con respecto a las células T solas, las células diana solas o las muestras de cocultivo sin TCE. Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM). Para las comparaciones múltiples con el mismo control (en el experimento de evaluación del donante), utilizamos ANOVA de una vía, seguida de la prueba de Dunnett. Para las comparaciones por pares múltiples (en el experimento de evaluación de las células tumorales), aplicamos ANOVA de una vía junto con la prueba de Tukey HSD. Se analizaron al menos tres muestras biológicas y tres réplicas técnicas para cada condición.

Edición del genoma CRISPR

Se analizó la región que rodea el residuo R273 del gen TP53 y se comparó utilizando Cas-Designer (http://www.rgenome.net/cas-designer/), Geneious Prime y la plataforma CRISPR de Benchling. Los posibles sitios diana se evaluaron para la puntuación de actividad de Cas9 y los posibles efectos fuera del objetivo utilizando Cas-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/). Se seleccionaron los dos mejores candidatos que cubrían ambos lados del residuo R273, y los ARN guía correspondientes se clonaron en el sistema multiplex separados por el tRNA. El plásmido que contenía Cas9 y el ARN guía multiplex se cotransfectó con una plantilla de reparación de ADN de cadena sencilla en las células diana de interés utilizando PEI 10 kDa. El ADN de los clones individuales se extrajo utilizando un tampón de lisis (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 2,5 mM MgCl2, 0,5% de Tween 20, 1× proteinasa K). El ADN extraído se utilizó para el análisis posterior, que incluyó la PCR genómica y la secuenciación de nueva generación (NGS).

Estudio de farmacocinética

Para estudiar la farmacocinética (PK), seis ratones suizos albino macho se asignaron aleatoriamente a cada grupo experimental de TCE que representaba las plataformas A, B, C y D, con diez ratones en el grupo control de PBS. Los ratones recibieron una inyección intravenosa (i.v.) a través de la vena de la cola con 5 mg/kg de fármaco o PBS. Se recogieron muestras de sangre a los 1, 2, 5, 24, 30, 48 y 72 h. Las muestras se centrifugaron y las fracciones de suero se almacenaron a -20 °C para su posterior análisis mediante ELISA. La experimentación con animales fue aprobada por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Ciencias de la Ciudad de Ho Chi Minh, Vietnam (número de protocolo 562/KHTN-ACUCUS).

Para ELISA, se añadieron a placas de inmunodepleción de 96 pocillos muestras (100 μL) diluidas en PBS y series de diluciones de concentraciones conocidas, y se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron 3 veces en PBS + 0,05% de Tween 20 (PBST), 300 μL por pocillo. Los TCE se detectaron utilizando el anticuerpo anti-Fc peroxidasa (Thermo Fisher Scientific, A18817) diluido 1:5.000 en 1% de BSA en PBST, mientras que TCER03 se detectó utilizando HRP conjugado con la etiqueta anti-DYKDDDDK (1:1.000, Thermo Fisher Scientific, A01428100). Los pocillos se lavaron cuatro veces con PBS y se revelaron con TMB (eBioscience, 00-4201-56). Cada muestra se midió por triplicado.

Los parámetros farmacocinéticos se calcularon mediante análisis no compartimental (NCA) utilizando Phoenix WinNonlin 8.5.2.4 con el modelo 201 (administración de bolo intravenoso). Para cada animal, la constante de velocidad de eliminación terminal (λz) se estimó mediante regresión log-lineal de la fase terminal (descendente) del perfil de concentración sérica a lo largo del tiempo, y la vida media terminal t1/2 se calculó como ln(2)/λz. Los animales para los cuales no se pudo identificar de forma fiable una fase log-lineal terminal (por ejemplo, debido a concentraciones no descendentes o no monótonas en la ventana terminal, lo que es consistente con el ruido del ensayo cerca del límite inferior de cuantificación o un aumento atípico de la concentración en la fase temprana que sugiere un artefacto de la dosis) se excluyeron de la estimación de λz y t1/2 para ese animal. El número de animales incluidos en cada estimación de la vida media a nivel de grupo se indica en la Tabla 1.

Declaración ética

Las muestras de sangre humana se recogieron con fines de investigación de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de Ética del Instituto de Genética Médica (número de aprobación 02/2024/CT-VDTYH) y se llevaron a cabo de acuerdo con los principios éticos de la Declaración de Helsinki (1964). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de cada participante de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Todos los procedimientos cumplieron con las directrices y regulaciones, y la recolección de muestras se realizó en el Instituto de Genética Médica.

Ingeniería, clonación y construcción de plásmidos de TCE

Para las secuencias de los variantes de TCE utilizados en este estudio, consulte la Tabla S7. Los plásmidos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla S8. Los plásmidos originales se obtuvieron de BioIntron (pcDNA 3.4 (+)), Takara Bio (pLVX Puro 632164), Invitrogen (plásmido de nucleasa CRISPR GeneArt OFP A21174) e Invitrogen (pcDNA 3.1 (+) V79020). Todos los constructos se diseñaron internamente y se ensamblaron utilizando la clonación de Gibson (Tabla S8). Los fragmentos de TCE o HLA se amplificaron utilizando la ADN polimerasa Q5 High Fidelity (NEB M0491S) o la ADN polimerasa GXL (Takara R050A), seguida del tratamiento con DpnI (NEB R0176L) y la purificación de PCR basada en isopropanol. Estos fragmentos se insertaron posteriormente en los vectores de pcDNA 3.4 (+) (para las estructuras de TCE) o pLVX (para los plásmidos que expresan lentivirus) mediante el ensamblaje de Gibson (Thermo Fisher A46628) siguiendo el procedimiento estándar. Los fragmentos ensamblados se transformaron en células competentes 10-beta (NEB C3019I) para los plásmidos de TCE o Stbl3 (Thermo Fisher C737303) para los plásmidos de lentivirus. Los plásmidos se verificaron mediante secuenciación de Sanger en DNA Sequencing Vietnam.

Producción y purificación de TCE

Los TCE se produjeron y purificaron internamente. Todos los TCE se generaron en células HEK293T, utilizando polietilenimina (PEI) de 10 kDa (Sigma-Aldrich 765090) o Lipofectamine 3000 (Invitrogen L3000015) en medio OptiMEM (Gibco 11058521) a 37 °C y 5% de CO2 durante 4 a 7 días. La expresión se evaluó antes de la purificación mediante dot-blot o SDS-PAGE con tinción con plata o ELISA utilizando anti-IgG humana (Fc específica)-HRP.

La purificación interna se realizó utilizando un sistema ÄKTA (Cytiva) con una columna HiTrap MabSelect PrismA (Cytiva 17549853) siguiendo las recomendaciones del fabricante con algunos ajustes, donde la columna se sometió a una disminución gradual del pH del citrato de 7,2 a 3,5. Las fracciones se evaluaron mediante SDS-PAGE al 8-10% con tinción con plata y los monómeros se purificaron aún más mediante cromatografía de exclusión por tamaño. Las fracciones de alto rendimiento y alta pureza se agruparon y se intercambiaron a un tampón de almacenamiento (0,55 mg/mL de ácido glutámico, 0,03 mg/mL de polisorbato 80, 28,5 mg/mL de sacarosa; pH 5,2).

Líneas celulares y cultivo

Todas las líneas celulares se mantuvieron a 37 °C con 5% de CO2. Las células embrionarias humanas del riñón para la producción de lentivirus (HEK293T, Takara Bio 632273), las células de carcinoma de colon (SW620 y ATCC CCL-227), las células de carcinoma de pulmón (NCI-H520 y ATCC HTB-182), las células de cáncer de mama (MDA-MB-468 y ATCC HTB-132), las células de cáncer de páncreas (PANC-1 y ATCC CRL-1469), las células madre derivadas del tejido adiposo humano (ASC) y los fibroblastos pulmonares (CCL-75 WI-38) se adaptaron y cultivaron en DMEM (Thermo Fisher 11995081) suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB) inactivado por calor (Thermo Fisher A5256701). Las células revividas de los bancos crioconservados se expandieron durante 3-4 pasajes antes de su uso.

Recolección de PBMCs y aislamiento de células T

Los PBMCs se aislaron de muestras de sangre de donantes utilizando Lymphoprep (Stemcell Technologies 07861) según el protocolo del fabricante con modificaciones menores. Brevemente, la sangre diluida se colocó en capas sobre Lymphoprep y se centrifugó a 1.000 × g durante 30 min a temperatura ambiente con aceleración y freno desactivados. Los PBMCs se congelaron inmediatamente para su almacenamiento o se sometieron a aislamiento de células T en un plazo máximo de 2 días.

Las células T CD3+ se aislaron de los PBMCs utilizando el kit de aislamiento de células T humanas EasySep (Stemcell Technologies 17951) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los linfocitos se resuspendieron a 5 × 107 células/mL y se incubaron con el cóctel de aislamiento (50 μL/mL) durante 5 min a temperatura ambiente, seguido de la adición de RapidSpheres (50 μL/mL). La mezcla se completó hasta 2,5 mL con medio de lavado (PBS que contiene 2% de SFB y 1 mM de EDTA, sin Ca2+/Mg2+). Las células CD3+ se capturaron magnéticamente y las células T CD3+ en el sobrenadante se recogieron y se resuspendieron en medio AIM-V.

Transfección transitoria de células

Para la transfección mediada por PEI, las células se cultivaron en medio sin antibióticos, se lavaron brevemente con PBS 1× precalentado (Cytiva SH30258.02) y se cultivaron en un volumen del 80% de Opti-MEM (Thermo Fisher 11058021). El ADN del plásmido se complejó con PEI (10 kDa; Sigma-Aldrich 765090) en una relación de 1:3 (p/p) en Opti-MEM durante 20-25 min a temperatura ambiente o 37 °C y se añadió por goteo a las células. Para la transfección mediada por Lipofectamine 3000, los plásmidos se prepararon según el protocolo del fabricante (Thermo Fisher L3000015) y se incubaron con las células durante 6 h antes de reemplazar con medio completo fresco.

Producción y transducción de lentivirus

Las células HEK293T (número de pasaje 95%. Los péptidos se resuspendieron en el disolvente adecuado siguiendo el certificado de análisis (CdA) del fabricante a una concentración de 20 mM y se almacenaron en alícuotas a -80 °C. Cada lote de péptidos se sometió a un máximo de dos ciclos de congelación-descongelación.

Pulsación de péptidos y cocultivo

Para la pulsación de péptidos, las células NCI-H520, MDA-MB-468 y SW620 que expresan el alelo HLA de interés se sembraron a una densidad de 6,25 × 104 células por cm2 en medio AIM-V suplementado con 0-2% de SFB y los péptidos relevantes a las concentraciones indicadas. Las células se incubaron durante 18-24 h a 37 °C bajo 5% de CO2. Las células pulsadas se lavaron una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y una vez con medio AIM-V suplementado con 5% de SFB, se resuspendieron y se sembraron a una densidad de 2 × 105 células por mL.

Para los experimentos de cocultivo, las células efectoras (PMBC o células T) se expandieron en medio AIM-V suplementado con 5% de SFB y luego se mezclaron con las células diana a las proporciones efector:diana (E:D) especificadas en presencia de los receptores de unión a células T (TCE) relevantes. Los cocultivos se mantuvieron durante 24-48 h antes del análisis posterior.

Citometría de flujo y tinción celular

Para obtener una lista completa de los anticuerpos utilizados en este estudio, consulte la Tabla S9. Para la tinción de la superficie celular, las células se lavaron tres veces en PBS 1× a hielo, se resuspendieron en PBS 1× a hielo y se incubaron con anticuerpos fluorocromados durante 30 min a 4 °C en la oscuridad. Las células se lavaron tres veces en PBS 1× a hielo antes del análisis. Para la tinción intracelular de perforina y granzima B, las células T se incubaron con el inhibidor del transporte de proteínas monensina (eBioscience, cat. no. 00-4505-51) durante 4-6 h a 37 °C bajo 5% de CO2. Las células se permeabilizaron con tampón de lavado de tinción intracelular (BioLegend, cat. no. 421002) durante 45 min, se lavaron dos veces y se tiñeron con los anticuerpos relevantes. Los datos de citometría de flujo se adquirieron en un citómetro de flujo Agilent NovoCyte.

Estrategia de clasificación: Las células singulares se identificaron utilizando los parámetros de dispersión frontal (FSC) y dispersión lateral (SSC). Después de la clasificación de las células singulares, las células vivas de interés se definieron utilizando marcadores específicos (CD3-PE-Cy7 para las células T y His-APC para las células SW620). Los marcadores de la activación de las células T y la producción de gránulos citotóxicos se evaluaron midiendo CD69-APC, perforina-AF700 y granzima B-PerCP, y se realizaron comparaciones entre las muestras tratadas con placebo y las muestras experimentales en las condiciones indicadas.

Ensayo de unión a células

Para los ensayos de unión a células, las células diana se incubaron con los TCE relevantes durante 1 h en un medio definido y luego se procedió con un anticuerpo secundario para la evaluación mediante citometría de flujo.

Ensayos funcionales a nivel celular

Las células pulsadas con péptidos se lavaron una vez en PBS 1x y una vez en AIM-V que contenía un 2% de FBS. Las células efectoras se cultivaron en medio AIM-V suplementado con un 2% durante al menos 24 h y se comprobó su viabilidad. A continuación, las células se cocultivaron con las células efectoras en presencia de los TCE relevantes. El sobrenadante se recogió para el ensayo ELISA de liberación de IFN-γ (Biolegend 430104). Simultáneamente, se recogieron las células T para los ensayos de activación de células T, como se describió anteriormente, y las células diana se sometieron a un ensayo de citotoxicidad basado en la luminiscencia utilizando Celltiter-Glo (Promega G9242). Ambos ensayos funcionales se realizaron siguiendo las instrucciones del fabricante.

Evaluación in silico de péptidos y predicción de complejos proteicos

La identificación de homólogos de péptidos se realizó utilizando NCBI Blast y Expasy ProScan con la base de datos de proteínas UniProt para Homo sapiens, utilizando un umbral de 4 desajustes. A continuación, se evaluaron los péptidos homólogos y los péptidos con alanina sustituida junto con el péptido H5 de 9 aminoácidos p53R273H para determinar su afinidad de unión con HLA-C∗01:02 utilizando NetMHC Pan 4.1 o la predicción de MHC-I. Los modelos de unión de los TCE con p53R273H/HLA-C∗01:02 y CD3 se realizaron utilizando una combinación de Python-scripted Alphafold 3.0, TCR model 2.3, Boltz-2 y TCR dock. Se utilizó PyMOL para evaluar y optimizar la visualización de los modelos.

Evolución dirigida basada en el aprendizaje automático

En resumen, se generó un complejo entre B2M, HLA-C∗01:02 y el péptido p53 R273H mediante Boltz-2, Alphafold 3.0 y el modelo TCR para garantizar la consistencia de la predicción de la estructura. A continuación, se añadió el TCE parental al complejo pHLA y se generó y evaluó la nueva estructura espacial del complejo utilizando los tres modelos mencionados. Este complejo se sometió a una evolución dirigida in silico mediante EvoPro, EvoProtGrad con un máximo de 50 mutaciones por ronda y 20 ciclos de optimización por ejecución, centrándose en la región TCR del TCE, mientras que la anti-CD3, la Fc del TCE y la pHLA permanecieron sin cambios. En cada ronda de evolución dirigida, se seleccionaron los 10 mejores candidatos de TCE con menor energía libre (ΔG) y menor energía libre de unión (ddG) para una evaluación adicional, que incluyó la afinidad de unión, la estabilidad y la agregación utilizando programas computacionales independientes. Por ejemplo, se probaron estos candidatos para determinar su afinidad de unión con HLA y el péptido presentado tanto a 25 °C como a 37 °C mediante PRODIGY. La puntuación de agregación se evaluó mediante el análisis de la distribución de residuos hidrofóbicos e hidrofílicos a lo largo de las secuencias TCR utilizando Aggrescan 3D y DeepSP. Además, también se evaluó el potencial de inmunogenicidad de los candidatos utilizando ABImmpred y Hu-mAb. Se eligió el mejor candidato por ronda entre los mejores resultados de cada categoría y se utilizó como estructura de partida para la siguiente ronda de evolución dirigida.

Formación de esferoides y administración de fármacos

Para evaluar los efectos citotóxicos de los activadores de células T (TCE) solos y en combinación con la quimioterapia, se generaron esferoides de cáncer colorrectal (CCR) en 3D. Se utilizaron oxaliplatino (MedChem Express, HY-17371) e irinotecán (MedChem Express, HY-16562) como agentes quimioterapéuticos junto con los TCE. Los esferoides se crearon mediante el cocultivo de células SW620 de CCR (ATCC, CCL-227), células endoteliales del cordón umbilical humano (HUVEC) y células estromales derivadas de tejido adiposo humano (ASC, Cellosaurus CVCL_4W37) en una proporción de 3:1:1, con un total de 6000 células, en placas de fondo redondo de 96 pocillos con ultra baja adherencia (Corning Costar, 7007). Las células se suspendieron en 200 μL de medio AIM-V (Gibco, 12055091) suplementado con un 5% de FBS (Gibco, 10437028) y, ya sea con la presencia de 2 μM o la ausencia del péptido H5 de 9 aminoácidos p53R273H para promover la presentación del antígeno específico del TCE en las células SW620 en modelos pulsados o endógenos. Las células SW620 y las ASC se transfectaron de forma estable con proteína fluorescente verde (GFP) y proteína fluorescente roja (RFP), respectivamente, para permitir la visualización de las interacciones tumor-estromales. Las placas se centrifugaron a 350 × g durante 5 minutos y se incubaron a 37 °C con un 5% de CO2 durante 48 horas para formar esferoides compactos.

Los esferoides se cocultivaron con 1 × 105 células T y se expusieron a agentes únicos (TCE01C, TCE01Cr3, oxaliplatino o irinotecán) o a sus combinaciones. Para los tratamientos únicos con TCE, los TCE01C y TCE01Cr3 se diluyeron 4 veces en un rango de 10 puntos (0,015-60 nM). Para los tratamientos únicos con quimioterapia, el oxaliplatino (0,2-200 μM) y el irinotecán (0,1-100 μM) se diluyeron 10 veces. En los estudios de combinación, los TCE (0,00015-60 μM) se combinaron con dosis subletales fijas de oxaliplatino (10 μM) o irinotecán (100 μM). Los controles consistieron en esferoides solos, esferoides con células T, células T solas y células T con oxaliplatino o irinotecán. Después de 48 horas, se evaluó la morfología del esferoide y la fluorescencia de la GFP utilizando un sistema de imagen EVOS M5000 (Thermo Fisher Scientific). La intensidad de la fluorescencia de la GFP se cuantificó con el software ImageJ (NIH, v1.53). Se recogieron los sobrenadantes para la medición de IFN-γ mediante un ensayo ELISA, como se describió anteriormente.^[22]

Análisis estadístico

La citotoxicidad mediada por las células T se evaluó utilizando el ensayo Celltiter-Glo, en el que la cantidad de ATP de las células vivas se utilizó para determinar la densidad de células vivas. El porcentaje de lisis celular específica se calculó utilizando la siguiente ecuación ^[1]:

Para el ensayo ELISA de liberación de IFN-γ, los resultados se normalizaron con respecto a las muestras cocultivadas sin TCE. Las señales de citometría de flujo se normalizaron con respecto a las células T solas, las células diana solas o las muestras cocultivadas sin TCE. Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM). Para las comparaciones múltiples con el mismo control (en el experimento de evaluación del donante), se utilizó ANOVA de una vía, seguido de la prueba de Dunnett. Para las comparaciones por pares múltiples (en el experimento de evaluación de las células tumorales), se aplicó ANOVA de una vía junto con la prueba de Tukey HSD. Se analizaron al menos tres muestras biológicas y tres réplicas técnicas para cada condición.

Edición genómica CRISPR

Se analizó la región que rodea el residuo R273 del gen TP53 y se comparó utilizando Cas-Designer (http://www.rgenome.net/cas-designer/), Geneious Prime y la plataforma Benchling CRISPR. Se evaluaron los posibles sitios diana para determinar la puntuación de actividad de Cas9 y los posibles efectos fuera de diana utilizando Cas-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/). Se seleccionaron los dos mejores candidatos que cubrían ambos lados del residuo R273, y los correspondientes ARNg se clonaron en el sistema multiplex separados por el tRNA. El plásmido que contenía Cas9 y el ARNg multiplex se cotransfectó con una plantilla de reparación de ADN de cadena sencilla en las células diana de interés utilizando PEI 10 kDa. El ADN de los clones individuales se extrajo utilizando un tampón de lisis (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 2,5 mM MgCl2, 0,5% Tween 20, 1× Proteinasa K). El ADN extraído se utilizó para el análisis posterior, que incluyó la PCR genómica y la secuenciación de nueva generación (NGS).

Estudio de farmacocinética

Para estudiar la farmacocinética (PK), se asignaron aleatoriamente seis ratones suizos albinos macho a cada grupo experimental de TCE que representaba las plataformas A, B, C y D, con diez ratones en el grupo control de PBS. Los ratones recibieron una inyección intravenosa (i.v.) a través de la vena de la cola con 5 mg/kg de fármaco o PBS. Se recogieron muestras de sangre a los 1, 2, 5, 24, 30, 48 y 72 horas. Las muestras se centrifugaron y las fracciones de suero se almacenaron a -20 °C para su posterior análisis mediante ELISA. El experimento con animales fue aprobado por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Ciencias de la Ciudad de Ho Chi Minh, Vietnam (número de protocolo 562/KHTN-ACUCUS).

Para el ELISA, se añadieron a las placas de inmunoabsorción de 96 pocillos 100 μL de muestras diluidas en PBS y series de diluciones de concentraciones conocidas, y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron 3 veces con PBS + 0,05% de Tween 20 (PBST), 300 μL por pocillo. Los TCE se detectaron utilizando un anticuerpo anti-Fc peroxidasa (Thermo Fisher Scientific, A18817) diluido 1:5000 en 1% de BSA en PBST, mientras que el TCER03 se detectó utilizando un anticuerpo anti-DYKDDDDK TAG conjugado con HRP (1:1000, Thermo Fisher Scientific, A01428100). Los pocillos se lavaron cuatro veces con PBS y se desarrollaron con TMB (eBioscience, 00-4201-56). Cada muestra se midió por triplicado.

Los parámetros farmacocinéticos se calcularon mediante análisis no compartimental (NCA) utilizando Phoenix WinNonlin 8.5.2.4 con el modelo 201 (administración en bolo intravenoso). Para cada animal, la constante de eliminación terminal (λz) se estimó mediante regresión log-lineal de la fase terminal (descendente) del perfil de concentración de suero en el tiempo, y la vida media terminal t1/2 se calculó como ln(2)/λz. Los animales para los que no se pudo identificar de forma fiable una fase log-lineal terminal (por ejemplo, debido a concentraciones no descendentes o no monotónicas en la ventana terminal, lo que es consistente con el ruido del ensayo cerca del límite inferior de cuantificación o un aumento de concentración en fase temprana atípica que sugiere un artefacto de dosificación) se excluyeron de la estimación de λz y t1/2 para ese animal. El número de animales incluidos en cada estimación de la vida media a nivel de grupo se indica en la Tabla 1.

Disponibilidad de datos y código

Los conjuntos de datos que respaldan las conclusiones de este estudio están disponibles en el archivo de datos fuente. Los materiales pertinentes se compartirán a petición.

Agradecimientos

Agradecemos a Que-Tran Bui Nguyen, Le Son Tran, Trung Quan Nguyen, Lyna Tran, Phuc M. Phung y Lan Tu por proporcionar amablemente los materiales utilizados en este estudio.

Las muestras de sangre de pacientes y donantes sanos se recogieron bajo la aprobación ética descrita en la Declaración de Ética anterior (Instituto de Genética Médica, número de aprobación 02/2024/CT-VDTYH). Las HUVEC y las células estromales derivadas del tejido adiposo (ASC) utilizadas en este estudio se obtuvieron de ATCC y no requirieron una aprobación ética institucional adicional.

Este estudio fue financiado por 10.13039/100032442 Gene Solutions.

Contribuciones de los autores

N.H., H.-N.N. y C.T.N. concibieron el estudio. N.H., T.-M.T.N., N.T.B., D.T.P.T. y C.T.N. desarrollaron la metodología y diseñaron los experimentos. N.H., T.-M.T.N., N.T.B., T.-N.H.N. y C.T.N. realizaron los experimentos. N.H., T.-M.T.N., N.T.B. y T.-N.H.N. realizaron la visualización. N.H., C.T.N. y H.-N.N. gestionaron la administración del proyecto, mientras que N.H., C.T.N. y H.-N.N. proporcionaron la supervisión. N.H. redactó el borrador original, y N.H., T.-M.T.N., N.T.B., D.T.P.T., T.-N.H.N., H.N.N. y C.T.N. revisaron y editaron el manuscrito.

Declaración de intereses

D.T.P.T. es co-inventor de la solicitud de patente 12442046, que incluye el descubrimiento de TCR12.1 dirigido al neoantígeno p53 R273H. N.H., T.-M.T.N., N.T.B., H.-N.N. y C.T.N. son co-inventores de la solicitud de patente 19059303, que incluye los TCR derivados del aprendizaje automático en este estudio y la generación de líneas celulares p53 R273H. Todos los autores son empleados de Gene Solutions Inc.

Declaración sobre el uso de IA generativa y tecnologías de asistencia por IA en el proceso de redacción

Durante la preparación de este manuscrito, los autores utilizaron ChatGPT (OpenAI) para ayudar a mejorar el lenguaje, la gramática, la legibilidad y la claridad del manuscrito. Los autores revisaron, editaron y verificaron todo el contenido generado con esta herramienta y asumen la total responsabilidad de la exactitud, originalidad e integridad del manuscrito final.