El inhibidor selectivo de KRAS (G12D) MRTX1133 suprime la proliferación y modula diferencialmente la quimiosensibilidad en el carcinoma mucinoso de ovario.

El cáncer de ovario es la sexta causa principal de mortalidad relacionada con el cáncer entre las mujeres en los Estados Unidos, con aproximadamente 21.000 nuevos casos y 13.000 muertes registradas anualmente (^[1]). El cáncer de ovario en etapa temprana a menudo es asintomático y numerosos pacientes son diagnosticados en etapas avanzadas con diseminación peritoneal o ascitis. El tratamiento estándar para el cáncer de ovario avanzado consiste en cirugía citorreductiva seguida de quimioterapia combinada con agentes a base de platino y taxanos. Aunque el cáncer de ovario es relativamente quimiosensible y varios pacientes logran la remisión con este enfoque multimodal, los efectos a menudo son transitorios y más del 50% de los pacientes finalmente presentan recurrencia (^[2],^[3]).

El carcinoma mucinoso de ovario (CMO) es uno de los subtipos histológicos del cáncer de ovario, que representa del 10 al 14% de todos los casos (^[4],^[5]). En comparación con el carcinoma seroso, que constituye la mayoría de los cánceres de ovario, el CMO exhibe una sensibilidad marcadamente baja a la quimioterapia y los casos avanzados se asocian con un mal pronóstico (^[6]–^[9]). A pesar de los avances recientes en el tratamiento del cáncer de ovario, incluidos los inhibidores de la poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) y las inmunoterapias (^[10]), las opciones de tratamiento para el CMO siguen siendo limitadas, lo que destaca la necesidad de nuevas estrategias terapéuticas.

Las mutaciones activadoras en KRAS se detectan en aproximadamente el 25% de todos los tipos de cáncer, con una alta prevalencia en los cánceres de páncreas y colon (^[11]). En el CMO, las mutaciones de KRAS se observan en aproximadamente el 50% de los casos, siendo la variante G12D la más frecuente (^[11],^[12]). MRTX1133 es un inhibidor no covalente y específico de KRAS (G12D) que ha demostrado una potente supresión de la proliferación en modelos de cáncer de páncreas y colon con mutación KRAS (G12D) tanto in vitro como in vivo (^[13],^[14]). Basándose en prometedores resultados preclínicos que demuestran una potente inhibición de la proliferación celular, la supresión de la fosforilación de ERK y la reducción del crecimiento tumoral en modelos con mutación KRAS (G12D) (^[13]), MRTX1133 se evaluó en un ensayo clínico de fase I/II (ID de clinicaltrials.gov NCT05737706) para pacientes con tumores sólidos avanzados con mutación KRAS (G12D), incluidos los cánceres de páncreas, colon y pulmón de células no pequeñas (^[15]). A diferencia de los cánceres de páncreas o colon, en los que MRTX1133 ha demostrado eficacia preclínica, hasta donde sabemos, la eficacia de MRTX1133 en el CMO aún no se ha explorado. El CMO exhibe un microambiente tumoral y un perfil de resistencia a la quimioterapia distintos, caracterizados por una abundante producción de mucina y una pobre respuesta clínica a la quimioterapia estándar a base de platino y taxanos en comparación con otros subtipos principales de cáncer de ovario (^[16]–^[18]). Estas características hacen que sea importante evaluar si la inhibición de KRAS (G12D) tiene una eficacia comparable y cómo se puede integrar de manera óptima con los estándares de tratamiento actuales. Dada la alta prevalencia de las mutaciones de KRAS (G12D) y la pobre respuesta del CMO a la quimioterapia convencional, dirigir KRAS (G12D) es un enfoque terapéutico racional y necesario. Por lo tanto, en el presente estudio, el objetivo fue dilucidar los efectos antitumorales y los mecanismos subyacentes del inhibidor selectivo de KRAS (G12D) MRTX1133 en las células de CMO y evaluar además sus interacciones con los agentes quimioterapéuticos convencionales para establecer una base para las estrategias de combinación.

Materiales y métodos

Líneas celulares y cultivo

MCAS, la línea celular humana de CMO, y la línea celular humana de adenocarcinoma seroso de ovario OVKATE se adquirieron del Banco de Bio recursos de Investigación de Japón. Las líneas celulares humanas de adenocarcinoma seroso de ovario SHIN-3 (^[19]) y TU-OS-4 (^[20]) se obtuvieron de los investigadores originales. Estas células se cultivaron en DMEM/F12 (Thermo Fisher Scientific, Inc.) suplementado con un 10% de FBS inactivado por calor (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) y un 1% de penicilina/estreptomicina (Thermo Fisher Scientific, Inc.) a 37 °C bajo 5% de CO2.

Mutaciones del gen KRAS

Las células OVKATE, SHIN-3 y TU-OS-4 se analizaron para detectar mutaciones del gen KRAS utilizando un método de secuenciación previamente publicado (^[21]). El ADN genómico se extrajo de las células utilizando un kit QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Inc.). La región de interés del gen KRAS (exón 2) se amplificó mediante PCR con ADN polimerasa EX Taq (Takara Bio, Inc.) y los siguientes cebadores: Directo, 5′-GTGTGACATGTTCTAATATAGTCA-3′; inverso, 5′-GAATGGTCCTGCACCAGTAA-3′. Las condiciones de termociclado fueron 94 °C durante 30 segundos, 64 °C durante 30 segundos y 72 °C durante 30 segundos para 45 ciclos. Los productos de PCR se corrieron en un gel de agarosa al 10% y se visualizaron bajo luz LED para confirmar una banda única antes de la secuenciación directa. La secuenciación se realizó utilizando el kit ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc.) en un analizador genético ABI PRISM 310 (Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Los cromatogramas de secuenciación se inspeccionaron visualmente en las posiciones de nucleótidos correspondientes a los codones 12 y 13 de KRAS para identificar las sustituciones de nucleótidos.

Análisis de Western blot

Se examinaron los efectos de MRTX1133 sobre la fosforilación de ERK, que actúa aguas abajo de KRAS en la vía MAPK. Las células MCAS se sembraron en placas de seis pocillos a 2 × 105 células/pocillo, se incubaron a 37 °C durante 24 horas y luego se cultivaron en un medio que contenía un 10% de FBS con 0 a 100 nM de MRTX1133 (TargetMol Chemicals, Inc.) a 37 °C durante 3 horas. Las células se lisaron utilizando un tampón de lisis (1% de NP-40, 150 mM de NaCl y 50 mM de Tris-HCl; pH 8.0). Las proteínas extraídas (10 µg por carril) se mezclaron con un tampón de muestra SDS al 1% (10 mM de Tris-HCl; pH 7.5; 150 mM de NaCl; 1% de SDS) suplementado con un cóctel de inhibidores de proteasas sin EDTA (Roche Diagnostics), se separaron mediante electroforesis utilizando geles de poliacrilamida al 10% y se transfirieron a membranas de PVDF (Merck KGaA). Las concentraciones de proteína se determinaron antes de la carga utilizando un ensayo de Bradford. Las membranas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora en PVDF Blocking Reagent for Can Get Signal® (Toyobo Co., Ltd.), se lavaron tres veces con tampón salino tamponado con Tris-Tween-20 (TBS-T) y se incubaron durante la noche con los siguientes anticuerpos diluidos 1:1000 a temperatura ambiente en Can Get Signal® Immunoreaction Enhancer Solution 1 (Toyobo Co., Ltd.): Anti-phospho-ERK (D13.14.4E; Cell Signaling Technology, Inc., cat. no. 4370), anti-ERK (137F5; Cell Signaling Technology, Inc., cat. no. 4695) y anticuerpo anti-α-actina (Sigma-Aldrich; Merck KgaA, cat. no. A2066). Después de la reacción, las membranas se lavaron tres veces con TBS-T y se incubaron con anticuerpos anti-conejo marcados con HRP (Rabbit IgG HRP Linked F(ab')2; cat. no. NA9340V; Cytiva) diluidos 1:1000 en Can Get Signal® Immunoreaction Enhancer Solution 2 (Toyobo Co., Ltd.) a temperatura ambiente durante 1 hora. Luego, las membranas se lavaron tres veces con TBS-T, se incubaron con el reactivo de detección de Western blot ECL Prime (Cytiva) y se obtuvieron imágenes utilizando un sistema de dispositivos de carga acoplados enfriado (ImageQuant™; LAS-4000mini; Cytiva).

Viabilidad celular

Primero, se evaluó el efecto de MRTX1133 solo sobre numerosas células de cáncer de ovario. Las células MCAS (500 células/pocillo) sembradas en placas de 96 pocillos se expusieron a MRTX1133 a concentraciones de 10 a 400 nM durante 72 horas a 37 °C. La viabilidad celular se evaluó mediante un ensayo colorimétrico utilizando el sistema de ensayo de proliferación celular Premix WST-1 (Takara Bio, Inc.), y los datos se presentaron como un porcentaje del control no tratado (libre de MRTX1133). Luego, se investigaron los efectos combinados de MRTX1133 y varios fármacos anticancerígenos sobre las células MCAS. Las células (500 células/pocillo) sembradas en placas de 96 pocillos se expusieron a cisplatino (CDDP; Nichi-Iko Pharmaceutical Co. Ltd.) a concentraciones de 4 a 128 µM, paclitaxel (PTX; Sawai Pharmaceutical Co., Ltd.) a concentraciones de 4 a 128 nM, SN38, el metabolito activo de irinotecán (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) a concentraciones de 0,05 a 1,6 µM o gemcitabina (GEM; Nichi-Iko Pharmaceutical Co. Ltd.) a concentraciones de 4 a 128 µM, con o sin MRTX1133 a concentraciones de 100 nM durante 72 horas a 37 °C. La viabilidad celular se evaluó como se mencionó anteriormente y se expresó como un porcentaje del control correspondiente no tratado con el fármaco.

Detección de muerte celular programada

Para investigar si las vías de muerte celular contribuyen al efecto de MRTX1133, se investigó la muerte celular programada después de la administración de MRTX1133. Las células MCAS (1000 células/pocillo) sembradas en una placa de 96 pocillos se expusieron al inhibidor de caspasas pan, Z-VAD-FMK (Abcam), al inhibidor específico de caspasa-1, Z-YVAD-FMK (Selleck Chemicals), al inhibidor de ferroptosis, ferrostatin-1 (Cayman Chemical Company) o al inhibidor de necroptosis, necrostatin-1 (Abcam) a concentraciones de 100 µM a 37 °C. Después de 1 hora, se retiró el medio y las células cancerosas se expusieron a MRTX1133 (100 nM) durante 48 horas a 37 °C. Se midió el recuento de células viables como se mencionó anteriormente y se expresó como un porcentaje del control no tratado con MRTX1133 y los inhibidores de la muerte celular programada.

RT-qPCR inversa

A continuación, se analizaron los niveles de expresión de varios genes relacionados con el ciclo celular. Las células MCAS (5 × 105 células/pocillo) sembradas en una placa de seis pocillos se expusieron a MRTX1133 a concentraciones de 100 nM durante 24 horas a 37 °C. El mRNA celular se extrajo utilizando el kit RNeasy Mini Kit (Qiagen, Inc.) según las instrucciones del fabricante. La transcripción inversa y la qPCR posterior se realizaron utilizando el kit One Step TB Green PrimeScript RT-PCR Kit II (Perfect Real Time; cat. no. RR066A; Takara Bio, Inc.), que incluye TB Green como fluoróforo, según el protocolo del fabricante. La RT-qPCR se realizó utilizando el sistema térmico de ciclo Dice Real Time System II (Takara Bio, Inc.) siguiendo las instrucciones del fabricante. La PCR se realizó utilizando 40 ciclos de calentamiento a 95 °C durante 15 segundos, 58 °C durante 15 segundos y 72 °C durante 20 segundos. Los niveles de mRNA se determinaron en relación con el nivel de señal de fluorescencia de GAPDH utilizando el método comparativo 2−ΔΔCq (^[22]). Las secuencias de los cebadores se muestran en la Tabla I.

Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó utilizando el software EZR, versión 4.5.2 (Saitama Medical Center; Jichi Medical University). Los datos de los ensayos de viabilidad celular y expresión de mRNA se presentan como la media ± DE de tres experimentos independientes. Se utilizaron pruebas t de Student no pareadas para las comparaciones entre dos grupos. Para las comparaciones que involucran múltiples grupos, se aplicó la corrección de Bonferroni. Se consideró que un valor de p < 0,01 indica una diferencia estadísticamente significativa.

Líneas celulares y cultivo

MCAS, la línea celular humana de CMO, y la línea celular humana de adenocarcinoma seroso de ovario OVKATE se adquirieron del Banco de Bio recursos de Investigación de Japón. Las líneas celulares humanas de adenocarcinoma seroso de ovario SHIN-3 (^[19]) y TU-OS-4 (^[20]) se obtuvieron de los investigadores originales. Estas células se cultivaron en DMEM/F12 (Thermo Fisher Scientific, Inc.) suplementado con un 10% de FBS inactivado por calor (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) y un 1% de penicilina/estreptomicina (Thermo Fisher Scientific, Inc.) a 37 °C bajo 5% de CO2.

Mutaciones del gen KRAS

Las células OVKATE, SHIN-3 y TU-OS-4 se analizaron para detectar mutaciones del gen KRAS utilizando un método de secuenciación previamente publicado (^[21]). El ADN genómico se extrajo de las células utilizando un kit QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Inc.). La región de interés del gen KRAS (exón 2) se amplificó mediante PCR con ADN polimerasa EX Taq (Takara Bio, Inc.) y los siguientes cebadores: Directo, 5′-GTGTGACATGTTCTAATATAGTCA-3′; inverso, 5′-GAATGGTCCTGCACCAGTAA-3′. Las condiciones de termociclado fueron 94 °C durante 30 segundos, 64 °C durante 30 segundos y 72 °C durante 30 segundos para 45 ciclos. Los productos de PCR se corrieron en un gel de agarosa al 10% y se visualizaron bajo luz LED para confirmar una banda única antes de la secuenciación directa. La secuenciación se realizó utilizando el kit ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc.) en un analizador genético ABI PRISM 310 (Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Los cromatogramas de secuenciación se inspeccionaron visualmente en las posiciones de nucleótidos correspondientes a los codones 12 y 13 de KRAS para identificar las sustituciones de nucleótidos.

Se examinaron los efectos de MRTX1133 sobre la fosforilación de ERK, que actúa aguas abajo de KRAS en la vía MAPK. Las células MCAS se sembraron en placas de seis pocillos a una concentración de 2×105 células/pocillo, se incubaron a 37 °C durante 24 h y luego se cultivaron en un medio que contenía un 10 % de FBS con 0-100 nM de MRTX1133 (TargetMol Chemicals, Inc.) a 37 °C durante 3 h. Las células se lisaron utilizando un tampón de lisis (1 % de NP-40, 150 mM de NaCl y 50 mM de Tris-HCl; pH 8,0). Las proteínas extraídas (10 µg por carril) se mezclaron con un tampón de muestra de SDS al 1 % (10 mM de Tris-HCl; pH 7,5; 150 mM de NaCl; 1 % de SDS) suplementado con un cóctel de inhibidores de proteasas sin EDTA (Roche Diagnostics), se separaron mediante electroforesis utilizando geles de poliacrilamida al 10 % y se transfirieron a membranas de PVDF (Merck KGaA). Las concentraciones de proteína se determinaron antes de la carga utilizando un ensayo de Bradford. Las membranas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h en el reactivo de bloqueo de PVDF para Can Get Signal® (Toyobo Co., Ltd.), se lavaron tres veces con solución salina tamponada con Tris-Tween-20 (TBS-T) y se incubaron durante la noche con los siguientes anticuerpos diluidos 1:1000 a temperatura ambiente en la solución de mejora de la reacción inmunoenzimática Can Get Signal® 1 (Toyobo Co., Ltd.): anti-fosfo-ERK (D13.14.4E; Cell Signaling Technology, Inc., n.º de catálogo 4370), anti-ERK (137F5; Cell Signaling Technology, Inc., n.º de catálogo 4695) y anticuerpo anti-α-actina (Sigma-Aldrich; Merck KgaA, n.º de catálogo A2066). Después de la reacción, las membranas se lavaron tres veces con TBS-T y se incubaron con anticuerpos anti-conejo marcados con HRP (Rabbit IgG HRP Linked F(ab')2; n.º de catálogo NA9340V; Cytiva) diluidos 1:1000 en la solución de mejora de la reacción inmunoenzimática Can Get Signal® 2 (Toyobo Co., Ltd.) a temperatura ambiente durante 1 h. A continuación, las membranas se lavaron tres veces con TBS-T, se incubaron con el reactivo de detección de Western blot ECL Prime (Cytiva) y se visualizaron utilizando un sistema de dispositivo de acoplamiento de carga enfriado (ImageQuant™; LAS-4000mini; Cytiva).

Viabilidad celular

En primer lugar, se evaluó el efecto de MRTX1133 solo sobre numerosas células de cáncer de ovario. Las células MCAS (500 células/pocillo) se sembraron en placas de 96 pocillos y se expusieron a MRTX1133 a concentraciones de 10-400 nM durante 72 h a 37 °C. La viabilidad celular se evaluó mediante un ensayo colorimétrico utilizando el sistema de ensayo de proliferación celular Premix WST-1 (Takara Bio, Inc.), y los datos se presentaron como un porcentaje del control no tratado (libre de MRTX1133). A continuación, se investigaron los efectos combinados de MRTX1133 y varios fármacos anticancerígenos sobre las células MCAS. Las células (500 células/pocillo) se sembraron en placas de 96 pocillos y se expusieron a cisplatino (CDDP; Nichi-Iko Pharmaceutical Co. Ltd.) a concentraciones de 4-128 µM, paclitaxel (PTX; Sawai Pharmaceutical Co., Ltd.) a concentraciones de 4-128 nM, SN38, el metabolito activo de irinotecán (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) a concentraciones de 0,05-1,6 µM o gemcitabina (GEM; Nichi-Iko Pharmaceutical Co. Ltd.) a concentraciones de 4-128 µM, con o sin MRTX1133 a concentraciones de 100 nM durante 72 h a 37 °C. La viabilidad celular se evaluó como se mencionó anteriormente y se expresó como un porcentaje del control correspondiente no tratado con el fármaco.

Detección de la muerte celular programada

Para investigar si las vías de muerte celular contribuyen al efecto de MRTX1133, se investigó la muerte celular programada tras la administración de MRTX1133. Las células MCAS (1000 células/pocillo) se sembraron en una placa de 96 pocillos y se expusieron al inhibidor de la caspasa pan, Z-VAD-FMK (Abcam), al inhibidor específico de la caspasa-1, Z-YVAD-FMK (Selleck Chemicals), al inhibidor de la ferroptosis, ferrostatin-1 (Cayman Chemical Company) o al inhibidor de la necroptosis, necrostatin-1 (Abcam) a concentraciones de 100 µM a 37 °C. Después de 1 h, se retiró el medio y las células cancerosas se expusieron a MRTX1133 (100 nM) durante 48 h a 37 °C. El recuento de células viables se midió como se mencionó anteriormente y se expresó como un porcentaje del control no tratado con MRTX1133 y los inhibidores de la muerte celular programada.

RT-qPCR (reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa)

A continuación, se analizaron los niveles de expresión de varios genes relacionados con el ciclo celular. Las células MCAS (5×105 células/pocillo) se sembraron en una placa de seis pocillos y se expusieron a MRTX1133 a concentraciones de 100 nM durante 24 h a 37 °C. El mRNA celular se extrajo utilizando el kit RNeasy Mini (Qiagen, Inc.) según las instrucciones del fabricante. La transcripción inversa y la qPCR posterior se realizaron utilizando el kit One Step TB Green PrimeScript RT-PCR Kit II (Perfect Real Time; n.º de catálogo RR066A; Takara Bio, Inc.), que incluye TB Green como fluoróforo, según el protocolo del fabricante. La RT-qPCR se realizó utilizando el sistema térmico de ciclado Dice Real Time System II (Takara Bio, Inc.) siguiendo las instrucciones del fabricante. La PCR se realizó utilizando 40 ciclos de calentamiento a 95 °C durante 15 segundos, 58 °C durante 15 segundos y 72 °C durante 20 segundos. Los niveles de mRNA se determinaron en relación con el nivel de señal de fluorescencia de GAPDH utilizando el método comparativo 2−ΔΔCq (^[22]). Las secuencias de los cebadores se muestran en la Tabla I.

Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó utilizando el software EZR, versión 4.5.2 (Saitama Medical Center; Jichi Medical University). Los datos de los ensayos de viabilidad celular y expresión de mRNA se presentan como la media ± DE de tres experimentos independientes. Se utilizaron pruebas t de Student no pareadas para las comparaciones entre dos grupos. Para las comparaciones que involucran múltiples grupos, se aplicó la corrección de Bonferroni. Se consideró que un valor de P < 0,01 indicaba una diferencia estadísticamente significativa.

Resultados

Estado de la mutación KRAS en líneas celulares de cáncer de ovario

En cada línea celular de cáncer de ovario se examinó el estado del gen KRAS. Si bien no se detectaron mutaciones en el codón 12 del exón 2 en las células OVKATE o TU-OS-4, se identificó una única mutación puntual G12S, GGT (glicina) a AGT (serina) en las células SHIN-3 en el codón 12 del exón 2 del gen KRAS (Fig. 1). En nuestro estudio anterior, se detectó la mutación del gen KRAS (G12D), en la que el codón 12 se sustituye de GGT (glicina) a GAT (ácido aspártico), en la línea celular MCAS (^[21]).

Supresión de la fosforilación de ERK por MRTX1133 en las células MCAS con mutación KRAS (G12D)

El tratamiento con MRTX1133 condujo a una supresión dependiente de la concentración de la fosforilación de ERK en las células MCAS (Fig. 2), lo que indica una inhibición eficaz de la vía MAPK por parte de MRTX1133 en las células con mutación KRAS (G12D).

Inhibición selectiva de la proliferación de células KRAS (G12D)-mutadas por MRTX1133

Los resultados de sensibilidad de cada línea celular de cáncer de ovario a MRTX1133 se presentan en la Fig. 3. MRTX1133 exhibió un efecto inhibidor de la proliferación dependiente de la concentración exclusivamente en las células MCAS, que albergan la mutación KRAS (G12D), con un valor de CI50 de 37,9 ± 5,9 nM. Por el contrario, la proliferación de las células OVKATE, TU-OS-4 y SHIN-3 no se vio afectada y no se alcanzaron los valores de CI50 dentro del rango de concentración probado (hasta 400 nM), lo que indica que MRTX1133 suprimió selectivamente la proliferación de las células MCAS con mutación KRAS (G12D).

Atenuación de la eficacia quimioterapéutica dependiente del ciclo celular por parte de MRTX1133

Los resultados de la quimiosensibilidad de las células MCAS a los agentes anticancerígenos, con o sin MRTX1133, se muestran en la Fig. 4. Los valores de CI50 para PTX, SN38 (el metabolito activo de irinotecán) y GEM aumentaron significativamente en presencia de MRTX1133: el CI50 de PTX aumentó de 10,8 ± 3,1 a 30,9 ± 1,1 nM (2,9 veces), el CI50 de SN38 aumentó de 0,2 ± 0,1 a 1,4 ± 0,2 µM (7,0 veces) y el CI50 de GEM aumentó de 0,8 ± 0,0 a 3,3 ± 0,6 µM (4,1 veces). Por el contrario, no se observó ningún cambio significativo para CDDP (9,4 ± 1,3 µM sin MRTX1133 frente a 7,6 ± 1,5 µM con MRTX1133). En conjunto, estos resultados indicaron que MRTX1133 aumentó significativamente los valores de CI50 de los agentes quimioterapéuticos dependientes del ciclo celular (PTX, SN38 y GEM), mientras que la eficacia del agente no dependiente del ciclo celular, CDDP, se mantuvo sin cambios.

Evidencia limitada de muerte celular programada tras el tratamiento con MRTX1133

Para determinar si la muerte celular programada contribuyó a la inhibición de la proliferación mediada por MRTX1133, las células MCAS se incubaron con inhibidores específicos de la apoptosis, la piroptosis, la ferroptosis y la necroptosis. Los resultados indicaron que ninguno de estos inhibidores restauró significativamente la viabilidad celular tras el tratamiento con MRTX1133 (Fig. 5), lo que sugiere que no se observó una activación robusta de estas vías de muerte celular programada en las condiciones experimentales.

Supresión de la expresión de mRNA relacionada con la proliferación y el ciclo celular por parte de MRTX1133

A continuación, se evaluaron los niveles de expresión de varios marcadores asociados a la proliferación y al ciclo celular. Ki-67 es un marcador de proliferación bien establecido (^[23], ^[24]) que se expresa en todas las fases activas del ciclo celular (G1, S, G2 y M), pero no en las células quiescentes (G0) (^[25]). En el presente estudio, MRTX1133 redujo la expresión de mRNA de Ki-67 en las células MCAS (Fig. 6). A continuación, se analizó la expresión de las ciclinas específicas de fase, y los resultados indicaron que las ciclinas D1, A2 y B1 se regularon al alza en las fases G1, S/G2 y G2/M, respectivamente (^[26]). El tratamiento con MRTX1133 disminuyó la expresión de mRNA de las tres ciclinas (Fig. 7).

A continuación, se evaluó la expresión de marcadores asociados con la proliferación y el ciclo celular. Ki-67 es un marcador de proliferación bien establecido (^[23], ^[24]) que se expresa en todas las fases activas del ciclo celular (G1, S, G2 y M), pero no en las células quiescentes (G0) (^[25]). En el presente estudio, MRTX1133 redujo la expresión de ARNm de Ki-67 en las células MCAS (Fig. 6). A continuación, se analizó la expresión de ciclinas específicas de cada fase, y los resultados indicaron que las ciclinas D1, A2 y B1 se sobreexpresaban en las fases G1, S/G2 y G2/M, respectivamente (^[26]). El tratamiento con MRTX1133 disminuyó la expresión de ARNm de las tres ciclinas (Fig. 7).

Discusión

El cáncer de ovario mucinoso (OMC), que con frecuencia presenta mutaciones en KRAS y muestra una respuesta deficiente a la quimioterapia basada en platino y taxanos (^[6]–^[9], ^[27]), sigue siendo una neoplasia con opciones terapéuticas limitadas, lo que destaca la necesidad de nuevas estrategias. En el presente estudio, se demostró que MRTX1133 inhibía selectivamente la proliferación de las células OMC con mutación KRAS (G12D). A nivel mecanicista, MRTX1133 suprimió la fosforilación de ERK de forma dependiente de la concentración, lo que sugiere que el efecto antiproliferativo se debió, al menos en parte, a la inhibición de la vía MAPK. Dado que las mutaciones de KRAS (G12D) se han estudiado en diversos tumores sólidos, incluidos los cánceres de páncreas, colon, conducto biliar y endometrio (^[11]), los hallazgos del presente estudio en OMC amplían aún más la posible aplicabilidad de la terapia dirigida a KRAS (G12D) a este raro subtipo de cáncer de ovario. Los efectos selectivos de la mutación observados en el presente estudio son coherentes con informes previos que demuestran la especificidad de MRTX1133 para KRAS (G12D), lo que apoya la interpretación de que la inhibición de la proliferación observada se debe principalmente al bloqueo de KRAS (G12D) a nivel del objetivo (^[13], ^[28]). Dado que KRAS activa varias vías descendentes, incluida la señalización PI3K/Akt/mTOR, la fosforilación de ERK se utilizó como un indicador farmacodinámico representativo y ampliamente aceptado de la inhibición de la señalización MAPK (^[13], ^[29], ^[30]). Aunque los niveles totales de proteína ERK aumentaron después del tratamiento con MRTX1133, lo que quizás refleja una regulación de retroalimentación compensatoria dentro de la vía MAPK (^[31]), la fosforilación de ERK se suprimió, lo que apoya la inhibición de la fosforilación de ERK y la actividad de señalización MAPK descendente.

En el cáncer de pulmón, las mutaciones de KRAS (G12C) se encuentran en el 7% de los casos (^[11]). El inhibidor específico de KRAS (G12C), sotorasib, ha demostrado eficacia en pacientes previamente tratados con quimioterapia o inhibidores de puntos de control inmunitario (^[32]) y actualmente se está utilizando en entornos clínicos (^[33], ^[34]). Estos éxitos clínicos de la inhibición de KRAS específica de mutaciones respaldan en conjunto la viabilidad general de la focalización del KRAS oncogénico y proporcionan una base conceptual y preliminar para el desarrollo de terapias dirigidas a KRAS (G12D) para el OMC. En particular, las líneas celulares de cáncer de ovario negativas para KRAS (G12D) no se vieron afectadas por MRTX1133 en el presente estudio, lo que sugiere una posible selectividad para la mutación G12D. Esta observación se alinea con los perfiles específicos de mutaciones informados para los inhibidores de KRAS (G12C) (^[34]–^[36]), como sotorasib, que se caracterizan por sus perfiles de seguridad relativamente manejables en entornos clínicos (^[13], ^[32]). Si bien las propiedades bioquímicas de KRAS (G12D) y KRAS (G12C) difieren y la seguridad clínica de los inhibidores de KRAS (G12D) aún no se ha establecido por completo, los datos in vitro del presente estudio sugieren un impacto limitado en las células KRAS de tipo salvaje. Esta selectividad podría traducirse potencialmente en una ventana terapéutica más amplia y respaldar la base para estrategias de combinación con agentes citotóxicos convencionales, incluidos los agentes basados en platino y taxanos. Estas combinaciones pueden ser particularmente beneficiosas para los regímenes limitados por toxicidades hematológicas superpuestas; sin embargo, se requeriría una validación in vivo para evaluar la seguridad sistémica.

Se evaluó la combinación de MRTX1133 con agentes quimioterapéuticos que se utilizan habitualmente en el cáncer de ovario. Si bien MRTX1133 no afectó la actividad de CDDP, un agente independiente del ciclo celular, redujo la sensibilidad a los agentes cuya eficacia depende de la progresión activa del ciclo celular, como PTX, SN38 y GEM. Para explorar los mecanismos subyacentes, se evaluaron numerosas formas de muerte celular programada, incluida la apoptosis, la piroptosis, la ferroptosis y la necroptosis, utilizando inhibidores específicos en el presente estudio (^[37], ^[38]). La inhibición de estas vías no restableció la viabilidad celular después del tratamiento con MRTX1133, lo que sugiere que la activación manifiesta de las vías canónicas de muerte celular programada no fue el mecanismo predominante de supresión de la proliferación en las condiciones experimentales probadas, lo que puede ocurrir en cambio a través de mecanismos alternativos, como la supresión del ciclo celular.

A continuación, se examinaron los marcadores asociados con la regulación del ciclo celular. En el presente estudio, se encontró que MRTX1133 redujo la expresión de Ki-67 en las células OMC con mutación KRAS (G12D), lo que indica una disminución de la actividad proliferativa. Además, se evaluó la expresión de ARNm de las ciclinas asociadas a la fase; las ciclinas D1, A2 y B1 están predominantemente asociadas con las fases G1, S/G2 y G2/M, respectivamente (^[26]). Coherente con la reducción de la expresión de Ki-67, el tratamiento con MRTX1133 resultó en una regulación a la baja coordinada de estas ciclinas a nivel de ARNm, lo que sugiere una atenuación general de los programas de transcripción relacionados con el ciclo celular en lugar de un bloqueo específico de la fase.

Los agentes quimioterapéuticos se clasifican como dependientes del ciclo celular e independientes del ciclo celular. PTX, SN38 y GEM son dependientes del ciclo celular, mientras que CDDP es independiente del ciclo celular (^[39]). MRTX1133 redujo la sensibilidad de las células OMC con mutación KRAS (G12D) a PTX, SN38 y GEM, pero no a CDDP. Estos resultados indicaron que la reducción de la actividad proliferativa inducida por MRTX1133 puede atenuar los efectos de los agentes quimioterapéuticos dependientes del ciclo celular al tiempo que minimiza los efectos sobre los agentes independientes del ciclo celular. Como agente de entrecruzamiento de ADN, CDDP probablemente mantiene su eficacia independientemente del estado del ciclo celular. Por lo tanto, la administración concurrente de MRTX1133 con agentes dependientes del ciclo celular puede ser contraproducente y la administración secuencial (quimioterapia citotóxica seguida de inhibición de KRAS) podría maximizar potencialmente la eficacia al tiempo que minimiza el antagonismo. Desde una perspectiva de programación, la administración secuencial puede ser preferible, en la que se administran agentes citotóxicos dependientes del ciclo celular durante la proliferación activa, seguida de MRTX1133 para suprimir el crecimiento tumoral residual a través de la inhibición sostenida de la vía KRAS. Estas estrategias merecen una evaluación sistemática en futuros estudios in vivo para determinar la mejor programación y el beneficio terapéutico.

La resistencia adquirida e intrínseca a las terapias dirigidas a KRAS también representa un desafío importante en la traslación clínica. La experiencia clínica con los inhibidores de KRAS (G12C), como sotorasib, ha revelado ciertos mecanismos, incluidas las mutaciones secundarias de KRAS, la reactivación de la vía MAPK y la señalización de derivación a través de las quinasas receptoras de tirosina u otros impulsores oncogénicos. Las alteraciones informadas incluyen la amplificación de MET, las mutaciones activadoras en NRAS, BRAF, MAP2K1 y RET, las fusiones oncogénicas que involucran a ALK, RET, BRAF, RAF1 y FGFR3, y las mutaciones de pérdida de función en NF1 y PTEN (^[40]). Aunque la resistencia a los inhibidores de KRAS (G12D) aún no se ha caracterizado bien, pueden surgir respuestas adaptativas similares, lo que subraya la necesidad de enfoques de combinación y el monitoreo molecular longitudinal en estudios futuros.

El presente estudio presenta ciertas limitaciones. En primer lugar, todos los experimentos se llevaron a cabo in vitro y se basaron principalmente en una única línea celular de cáncer de ovario con mutación KRAS (G12D), MCAS. Hasta donde sabemos, MCAS es actualmente la única línea celular de OMC disponible que alberga esta mutación específica. Si bien este modelo proporciona una plataforma valiosa para investigar la terapia dirigida a KRAS (G12D), no recapitula completamente el microambiente tumoral, la exposición sistémica a los fármacos o la heterogeneidad intratumoral observada in vivo. Por lo tanto, la validación en modelos adicionales, incluidos los derivados de pacientes, los organoides o los sistemas de xenoinjerto, es necesaria para determinar aún más la eficacia y la seguridad terapéuticas.

En segundo lugar, no se realizaron experimentos formales de rescate genético para validar aún más la especificidad del objetivo. Si bien la sobreexpresión de KRAS de tipo salvaje o una mutación de KRAS resistente a los fármacos proporcionaría una demostración mecanicista adicional, estos experimentos requieren una manipulación genética estable y una optimización exhaustiva. Dado que el objetivo principal del presente estudio era evaluar las consecuencias biológicas de la inhibición farmacológica de KRAS (G12D) en lugar de restablecer la especificidad bioquímica de MRTX1133 (ya ampliamente validada en estudios anteriores) (^[13], ^[28]), el presente estudio se basó en cambio en las respuestas de proliferación selectivas de mutaciones en numerosas líneas celulares de cáncer de ovario. A pesar de esto, la ausencia de experimentos de rescate genético representa una limitación y debe abordarse en futuros estudios mecanicistas.

En tercer lugar, la evidencia de la supresión del ciclo celular se basó principalmente en los cambios transcripcionales en los genes asociados con la proliferación y el ciclo celular. El análisis funcional de la distribución del ciclo celular mediante citometría de flujo no fue factible debido a las características biológicas de la línea celular MCAS. Las células MCAS exhiben una marcada adhesión célula-célula y abundante producción de matriz extracelular (^[18], ^[41], ^[42]), y los repetidos intentos de generar suspensiones de células individuales requirieron una extensa disociación enzimática y mecánica. Estos procedimientos han dado lugar constantemente a una formación de residuos notable y a agregados celulares persistentes, lo que compromete gravemente la resolución del histograma de ADN y dificulta el análisis citométrico de flujo confiable, incluido el análisis del ciclo celular basado en la tinción con PI. Además, nuestros repetidos análisis preliminares de Western blot (^[18]) de varios reguladores clave del ciclo celular, incluidas la ciclina D1 y la ciclina A2, produjeron señales inconsistentes o no específicas a pesar de los esfuerzos de optimización, lo que impidió una validación sólida a nivel de proteína. En consecuencia, los hallazgos del presente estudio respaldaron la supresión transcripcional de la señalización proliferativa, pero no establecieron una detención definitiva del ciclo celular mediada por proteínas o específica de la fase.

En cuarto lugar, no se realizaron ensayos bioquímicos directos de la apoptosis. En el presente estudio, la muerte celular programada se evaluó principalmente utilizando inhibidores farmacológicos que se dirigen a numerosas vías. Sin embargo, los enfoques basados en inhibidores por sí solos no pueden excluir definitivamente la apoptosis u otras formas de muerte celular. En las condiciones experimentales probadas, MRTX1133 indujo una inhibición sostenida de la proliferación, lo que es consistente con un fenotipo predominantemente citostático, sin evidencia clara de citotoxicidad. Estudios previos han demostrado que MRTX1133 suprime marcadamente la señalización KRAS-MAPK y la proliferación de células tumorales en modelos con mutación KRAS (G12D), un hallazgo que apoya una respuesta predominantemente citostática in vitro (^[13], ^[28]). En consecuencia, los ensayos bioquímicos de la apoptosis no se priorizaron en el presente estudio. No obstante, la ausencia de ensayos bioquímicos directos, como la actividad de la caspasa-3/7 o la detección de la caspasa-3 y la PARP escindidas, representa una limitación, por lo que no se puede excluir por completo la señalización apoptótica de bajo nivel o retardada.

Finalmente, aunque la sensibilidad reducida a los agentes quimioterapéuticos dependientes del ciclo celular observada después del tratamiento con MRTX1133 puede reflejar en parte la supresión de la señalización proliferativa, no se investigaron directamente mecanismos alternativos de interacción farmacológica. En particular, se ha informado que la señalización de KRAS modula la expresión y la actividad de los transportadores de eflujo de fármacos, incluidos los transportadores de unión a ATP (ABC), como ABCB1 y ABCG2 (^[43]). Estos transportadores pueden reducir la acumulación intracelular de fármacos al exportar activamente los agentes citotóxicos de las células cancerosas, disminuyendo así las concentraciones intracelulares efectivas de fármacos y atenuando la citotoxicidad (^[43]). Además, los estudios clínicos y preclínicos sobre los inhibidores de KRAS han destacado una serie de posibles mecanismos de señalización adaptativos y de evasión, incluida la reactivación de MAPK y la señalización a través de otros factores oncogénicos, que se han relacionado con la resistencia a las terapias dirigidas a KRAS (^[44]). Si bien estos mecanismos se relacionan principalmente con la resistencia a la inhibición de KRAS en sí, es concebible que estos cambios en la señalización adaptativa interactúen con las respuestas celulares a los agentes citotóxicos cuando se utilizan en combinación. La evaluación exhaustiva de estos mecanismos requeriría enfoques adicionales, como la elaboración de perfiles de expresión de transportadores, los ensayos de acumulación intracelular de fármacos y los análisis metabolómicos, lo que iba más allá del alcance del presente estudio.

A pesar de estas limitaciones, los resultados del presente estudio proporcionaron información mecanística inicial sobre los efectos biológicos de la inhibición de KRAS (G12D) en el CCO y respaldan una mayor investigación de las estrategias terapéuticas dirigidas a KRAS (G12D) en esta neoplasia poco frecuente.

En resumen, MRTX1133 redujo selectivamente la proliferación de las células de CCO con mutación KRAS (G12D), junto con la inhibición de la fosforilación de ERK y la actividad de señalización de MAPK aguas abajo. Estos hallazgos proporcionan evidencia preclínica del potencial beneficio de la terapia dirigida a KRAS (G12D) en el CCO y sugieren que la programación del tratamiento puede influir en la eficacia de las estrategias de combinación con quimioterapia dependiente del ciclo celular. Dada la investigación clínica de los inhibidores de KRAS (G12D), incluido el ensayo de fase I/II de MRTX1133 (NCT05737706), los resultados del presente estudio respaldan una mayor exploración de este enfoque terapéutico en el CCO. Se requieren estudios in vivo y clínicos adicionales para aprovechar al máximo el potencial terapéutico de este enfoque y para guiar el desarrollo de estrategias terapéuticas de precisión para el CCO impulsado por KRAS (G12D).