La mutagénesis asociada a la terapia en los sitios de unión de CTCF está influenciada por el contexto de la cromatina y la capacidad de reparación del ADN.

Muchas terapias contra el cáncer ejercen efectos citotóxicos al inducir daño en el ADN [^[1],^[2]]. En las células tumorales supervivientes, la reparación imperfecta de las lesiones inducidas por la terapia puede dar lugar a mutaciones somáticas fijas que dejan huellas mutacionales detectables en el genoma del cáncer [^[3]]. Sin embargo, la acumulación de mutaciones en todo el genoma del cáncer no es uniforme [^[4],^[5]] y está influenciada por el momento de la replicación, la organización de la cromatina, la actividad transcripcional, la unión de factores de transcripción y el contexto de la secuencia local [^[6]–^[13]]. A escalas genómicas finas, las interacciones proteína-ADN y la accesibilidad local a la reparación pueden influir en si el daño se repara con éxito o da lugar a mutaciones [^[14]]. Comprender cómo el daño en el ADN inducido por la terapia interactúa con estas capas de organización genómica es esencial para interpretar las consecuencias evolutivas del tratamiento del cáncer en el tumor.

Los sitios de unión de CTCF son elementos reguladores en el ADN no codificante que exhiben un enriquecimiento localizado recurrente de mutaciones en múltiples tipos de cáncer [^[10],^[15]–^[19]]. CTCF es una proteína arquitectónica clave que organiza los dominios de cromatina y los dominios asociados topológicamente (TAD), y sus sitios de unión anclan las interacciones regulatorias en todo el genoma [^[20]]. Nuestro trabajo previo demostró que los sitios de unión de CTCF constitutivamente activos, definidos como sitios unidos por CTCF en diversos tipos de tejidos, exhiben el enriquecimiento localizado de mutaciones más fuerte en múltiples tipos de cáncer [^[19]]. En particular, se ha demostrado que la unión de factores de transcripción en los sitios de unión de CTCF dificulta la reparación por escisión de nucleótidos, lo que sugiere que la ocupación sostenida de CTCF puede restringir la reparación local y aumentar la susceptibilidad a las mutaciones [^[14],^[17]]. Además, observamos previamente que los sitios de unión de CTCF altamente mutados están frecuentemente co-unidos por TOP2B, una topoisomerasa involucrada en la generación y reparación de roturas de doble cadena del ADN y un objetivo no deseado de ciertos agentes quimioterapéuticos [^[21]]. Dado que estos sitios contribuyen a la arquitectura de la cromatina de orden superior, las mutaciones en los sitios de unión de CTCF tienen el potencial de interrumpir los dominios regulatorios y afectar a múltiples genes [^[10],^[22],^[23]]. Las consecuencias mutacionales de varios agentes quimioterapéuticos y la radioterapia se han caracterizado en los genomas del cáncer [^[3],^[24]–^[27]]. Sin embargo, aún no está claro cómo se distribuye la mutagénesis asociada a la terapia en clases específicas de elementos reguladores y si el daño en el ADN se fija preferentemente en sitios con una accesibilidad a la reparación restringida. En particular, el impacto de las terapias genotóxicas en los elementos reguladores no codificantes, incluidos los sitios de unión de CTCF, no se ha evaluado sistemáticamente en grandes cohortes de tumores tratados.

Dado que los sitios de unión de CTCF son susceptibles a la mutagénesis somática, hipotetizamos que las terapias contra el cáncer genotóxicas pueden aumentar preferentemente el enriquecimiento de mutaciones en estos sitios en las células tumorales supervivientes. Para abordar esta cuestión, analizamos los datos de secuenciación del genoma completo de una gran cohorte de tumores metastásicos que abarca múltiples tipos de cáncer importantes, evaluando sistemáticamente el enriquecimiento de mutaciones asociado a la terapia en los sitios de unión de CTCF constitutivamente activos. Identificamos asociaciones entre las terapias genotóxicas y el aumento del enriquecimiento de mutaciones en los sitios de unión de CTCF en el cáncer colorrectal metastásico, y descubrimos que estos efectos se modulaban por el contexto de la cromatina local y las alteraciones específicas del tumor en las vías de respuesta al daño del ADN. En conjunto, estos hallazgos sugieren que las terapias contra el cáncer pueden remodelar la mutagénesis en los elementos reguladores de una manera influenciada tanto por la arquitectura genómica como por la capacidad de reparación.

Resultados

Las terapias contra el cáncer se asocian con un enriquecimiento localizado de mutaciones en los sitios de unión de CTCF constitutivamente activos

Analizamos los datos de secuenciación del genoma completo (WGS) de 4870 tumores metastásicos de 17 tipos de cáncer de la cohorte de la Fundación Médica Hartwig (HMF) [^[28]] (Tabla S1). Para evaluar si las terapias contra el cáncer se asocian con la mutagénesis localizada en los sitios de unión de CTCF (CBS), nos centramos en aproximadamente 30.000 sitios de unión de CTCF constitutivamente activos identificados en muchos tipos de tejidos humanos [^[19]] (Tabla S2). Este subconjunto se definió como sitios unidos por CTCF en la mayoría de los tipos de células perfilados en el proyecto ENCODE [^[29]] y se seleccionó para nuestro análisis debido a un fuerte enriquecimiento de mutaciones en los genomas del cáncer [^[19],^[21]]. Los CBS se definieron como secuencias centrales de 50 pares de bases alrededor de los puntos medios de los picos de ChIP-seq, y se compararon los recuentos de mutaciones somáticas dentro de estas regiones con las secuencias adyacentes coincidentes como controles de fondo locales. Los recuentos de mutaciones se modelaron utilizando RM2, un modelo binomial negativo que tiene en cuenta el contexto de la secuencia de trinucleótidos y la carga de mutaciones de fondo a escala de megabases, para cuantificar el enriquecimiento o el agotamiento de mutaciones específico de CBS [^[19]].

Primero, realizamos un análisis computacional sistemático para identificar pares de tipos de cáncer y terapias asociados con cambios localizados en el enriquecimiento de mutaciones en los CBS (Figura 1a, Figura S1). Evaluamos 45 terapias individuales y 15 grupos de terapias en 17 tipos de cáncer, requiriendo un mínimo de 25 tumores tratados y 25 tumores no tratados en cada par para garantizar la potencia estadística (Tablas S1, S3). Para cada par de cáncer-terapia elegible, utilizamos RM2 para cuantificar el enriquecimiento de mutaciones en los CBS en relación con las regiones adyacentes inmediatas, que sirvieron como fondo local coincidente. Luego, probamos estadísticamente si la exposición al tratamiento se asoció con un cambio en la relación de enriquecimiento de mutaciones de CBS a flancos, seguido de un ajuste de múltiples pruebas de las estimaciones de significación.

En este análisis sistemático, identificamos 20 asociaciones significativas que involucraron a 13 terapias y cinco tipos de cáncer (FDR < 0,05; Figura 1b, Tabla S1). Entre estos, el cáncer colorrectal metastásico exhibió múltiples asociaciones fuertes y estadísticamente sólidas, con varias terapias que mostraron aumentos significativos en el enriquecimiento de mutaciones en los CBS en relación con las regiones genómicas adyacentes. En el cáncer colorrectal metastásico, la radioterapia y la exposición a trifluridina mostraron las asociaciones más fuertes con el enriquecimiento de mutaciones en los CBS. Los tumores colorrectales tratados con radioterapia (n = 172) mostraron un enriquecimiento de mutaciones de 1,33 veces en los CBS en relación con las secuencias genómicas adyacentes, en comparación con un enriquecimiento de 1,24 veces en 449 tumores no tratados (FDR = 3,6 × 10−4 de RM2; Figura 1c). La exposición a trifluridina se asoció con un aumento del enriquecimiento de mutaciones en los CBS de 1,52 veces en 35 tumores tratados, en comparación con un aumento de 1,22 veces en 742 tumores no tratados (FDR = 4,9 × −13, Figura 1d). Varias terapias adicionales que se utilizan comúnmente para tratar a pacientes con cáncer colorrectal, como irinotecán, fluorouracilo, bevacizumab y agentes anti-EGFR, también mostraron asociaciones significativas con el enriquecimiento de mutaciones en los CBS (Figura 1b, Tabla S1). Sin embargo, dado que estas terapias se administraron con frecuencia en combinación, sus contribuciones individuales requieren una deconvolución adicional. Estos resultados indican que los CBS constitutivamente activos son un objetivo destacado de la mutagénesis asociada a la terapia en el cáncer colorrectal metastásico.

Más allá del cáncer colorrectal, identificamos algunas asociaciones significativas entre la terapia y el enriquecimiento de mutaciones en los CBS en otros tipos de cáncer. Por ejemplo, la exposición a bevacizumab se asoció con un aumento del enriquecimiento de mutaciones en los CBS en el cáncer de mama luminal A (FDR = 0,0011; Figura 1e). Sin embargo, estas asociaciones generalmente mostraron tamaños de efecto modestos o se respaldaron con un número limitado de muestras, lo que redujo su idoneidad para análisis posteriores detallados (Tabla S1). En contraste, la exposición a radioterapia y trifluridina en el cáncer colorrectal metastásico se respaldó con cohortes más grandes (Tabla S4) y mostró un enriquecimiento de mutaciones en los CBS fuerte y reproducible, lo que permitió una evaluación rigurosa de los efectos independientes del tratamiento. Por lo tanto, nos centramos en nuestros análisis posteriores en las asociaciones de tratamiento en el cáncer colorrectal metastásico para investigar los factores que dan forma a la mutagénesis asociada a la terapia en los CBS.

La radioterapia y la trifluridina se asocian con el enriquecimiento de mutaciones en los sitios de unión de CTCF en el cáncer colorrectal

Dado que muchos pacientes con cáncer colorrectal recibieron múltiples terapias, hubo una superposición sustancial entre los tratamientos que mostraron asociaciones significativas en el análisis sistemático inicial. Para desenredar sus contribuciones independientes, ajustamos un modelo conjunto que incluía las seis terapias contra el cáncer colorrectal identificadas a partir del análisis inicial (trifluridina, radioterapia, irinotecán, bevacizumab, fluorouracilo y terapia anti-EGFR). En este modelo, la radioterapia y la trifluridina siguieron asociadas significativamente con un aumento del enriquecimiento de mutaciones en los CBS (P = 0,0050 y P = 0,036, respectivamente, Figura 2a), mientras que las otras terapias se atenuaron en gran medida y ya no fueron significativas. Estos resultados indican que las asociaciones de la radioterapia o la trifluridina con el enriquecimiento de mutaciones en los CBS no se explican por el cotratamiento con otros agentes. Por lo tanto, nos centramos en nuestros análisis posteriores en estas dos terapias.

Para evaluar aún más si la asociación entre la radioterapia y el enriquecimiento de mutaciones en los CBS era robusta al contexto del tratamiento, estratificamos los tumores colorrectales tratados con radioterapia por las combinaciones de otras terapias que recibieron los pacientes (Figura 2b, Tabla S5). En particular, los tumores que recibieron radioterapia como su único tratamiento documentado exhibieron un enriquecimiento significativamente mayor de mutaciones en los CBS en comparación con los tumores sin exposición al tratamiento registrado (FDR = 4,5 × 10−6 de RM2; Figura 2c). Esta comparación proporciona evidencia de que la exposición a la radioterapia en sí está asociada con un enriquecimiento localizado de mutaciones en los CBS, independientemente de otras terapias. En los otros grupos de tratamiento de fondo, los tumores tratados con radioterapia generalmente mostraron un mayor enriquecimiento de mutaciones en los CBS que los tumores sin radioterapia (Figura 2b). Sin embargo, la mayoría de las comparaciones individuales se vieron limitadas por el tamaño de la muestra dentro de cada subgrupo y no alcanzaron la significación estadística después de la corrección de múltiples pruebas.

La radioterapia se administra con mayor frecuencia a los cánceres rectales que a los cánceres de colon [^[30]], a pesar de que estos tipos de tumores comparten características genómicas y transcripcionales muy similares [^[31],^[32]], lo que sugiere la posibilidad de que la ubicación del tumor pueda confundir la asociación observada. Analizamos los cánceres de colon y recto por separado y observamos un enriquecimiento significativo de mutaciones en los CBS asociado a la radioterapia tanto en la cohorte de cáncer de colon (P = 1,0 × −4) como en la cohorte de cáncer de recto (P = 8,0 × 10−4) (Figura 2d–e). Para minimizar aún más los posibles efectos de confusión, realizamos una comparación estricta entre los tumores colorrectales expuestos solo a la radioterapia (n = 13) y los tumores no tratados que coincidieron en el tamaño de la muestra y la proporción de cáncer de recto. Incluso bajo este diseño conservador, los tumores tratados solo con radioterapia mostraron un enriquecimiento significativamente mayor de mutaciones en los CBS que los tumores completamente no tratados (P = 0,032 de RM2; Figura S2), lo que indica que la asociación no se debe a la ubicación del tumor.

El contexto de la cromatina y los motivos de unión al ADN dan forma al enriquecimiento de mutaciones en los sitios de unión de CTCF

Centrándonos en los cánceres colorrectales tratados con radioterapia, examinamos a continuación si las características genómicas y de cromatina locales modulan el enriquecimiento de mutaciones en los sitios de unión. Anotamos los CBS constitutivamente activos con múltiples propiedades, incluido el presencia de un motivo de unión al ADN de CTCF canónico, el momento de la replicación, el nivel de expresión de los genes cercanos, el anclaje del bucle de cromatina y el contexto del dominio asociado topológicamente (TAD). Los CBS se estratificaron por cada característica, y se aplicó RM2 dentro de los estratos para evaluar los cambios asociados a la radioterapia en el enriquecimiento de mutaciones en relación con las regiones adyacentes. En estos análisis, el enriquecimiento de mutaciones y su asociación con la radioterapia se vieron fuertemente influenciados por la presencia del motivo del ADN, el momento de la replicación y la actividad transcripcional, mientras que el anclaje del bucle de cromatina y el contexto del TAD mostraron poco o ningún efecto (Figura 3a, Tabla S6).

La presencia de un motivo de unión al ADN CTCF canónico surgió como el determinante más importante del enriquecimiento de mutaciones en los CBS (Figura 3a–b). Los CBS que contenían el motivo canónico mostraron un claro enriquecimiento de mutaciones en relación con las regiones adyacentes, tanto en los tumores tratados con radioterapia como en los no tratados. Es importante destacar que la exposición a la radioterapia se asoció con un mayor aumento del enriquecimiento de mutaciones en los CBS que contenían el motivo (P = 3,4 × 10−5 según RM2). En contraste, los CBS que carecían del motivo canónico mostraron poco o ningún enriquecimiento de mutaciones en ninguno de los grupos de tratamiento y no se detectó ningún efecto asociado a la radioterapia. Estos resultados indican que el enriquecimiento de mutaciones está altamente concentrado en los CBS con motivos de unión al ADN CTCF, tanto en la línea de base como después de la exposición a la radioterapia, lo que amplía las observaciones previas sobre la mutagénesis centrada en los CBS [^[19]]. Dado que la presencia del motivo es un indicador de la interacción directa y estable entre CTCF y el ADN [^[33]], este patrón es consistente con la idea de que la unión sostenida de proteínas puede restringir la reparación local del ADN y, por lo tanto, aumentar la probabilidad de que el daño inducido por la radiación se fije como mutaciones somáticas.

La actividad transcripcional y el momento de la replicación modulan aún más el enriquecimiento de mutaciones en los CBS y su asociación con la exposición a la radioterapia. Para estudiar las asociaciones transcripcionales, agrupamos los CBS en función de la baja, media o alta expresión génica. Tanto en los grupos de baja como de media expresión, la exposición a la radioterapia se asoció con un aumento significativo del enriquecimiento de mutaciones en los CBS (CBS de baja expresión, P = 7,5 × 10−4; CBS de expresión media, P = 0,02; RM2) (Figura 3a, c). De manera similar, los CBS en las regiones genómicas de replicación tardía mostraron un enriquecimiento de mutaciones significativamente mayor en los genomas de los tumores que habían recibido radioterapia previamente (P = 3,4 × 10−5; Figura 3a, d). En ambas comparaciones, tanto los subconjuntos de tumores tratados como los no tratados mostraron enriquecimientos de mutaciones en los CBS en comparación con las regiones genómicas adyacentes (Figura 3a, c–d). En contraste, los CBS cerca de los genes altamente expresados o en las regiones genómicas de replicación temprana mostraron poco o ningún efecto asociado a la radioterapia y ningún enriquecimiento de mutaciones en los CBS en general. Dado que la eficiencia de la reparación del ADN se reduce en las regiones de replicación tardía y la reparación acoplada a la transcripción opera principalmente en las regiones activamente transcritas [^[34],^[35]], estos patrones son consistentes con la idea de que la mutagénesis asociada a la radioterapia afecta preferentemente a los CBS ubicados en contextos genómicos con una actividad de reparación limitada. En general, estos resultados indican que el enriquecimiento de mutaciones en los CBS, y su aumento por la radioterapia, está fuertemente influenciado por la presencia del motivo del ADN y el contexto cromatínico local.

El enriquecimiento de mutaciones asociado al tratamiento en los sitios de unión a CTCF está dominado por SBS5

A continuación, examinamos el espectro mutacional subyacente al enriquecimiento de mutaciones en los CBS asociado al tratamiento. En el cáncer colorrectal metastásico, el aumento de la carga de mutaciones en los CBS fue abrumadoramente impulsado por las variantes de un solo nucleótido (SNV), que representaron la gran mayoría de las mutaciones en los CBS (94 %). De hecho, las SNV estaban altamente enriquecidas en los sitios en relación con las secuencias adyacentes, y la exposición a la radioterapia se asoció con un mayor aumento del enriquecimiento de mutaciones (FDR = 3,9 × 10−5 según RM2; Figura 4a, Tabla S7). En contraste, los indels en los CBS estaban disminuidos en relación con las regiones adyacentes (P < 0,0001) y no se identificó ninguna asociación con la exposición a la radioterapia con las mutaciones de indels en los CBS (Figura 4b), a pesar de los informes previos que relacionan la radiación ionizante con las pequeñas deleciones [^[27]]. Por lo tanto, nos centramos en los análisis posteriores en las SNV.

Para determinar qué procesos mutacionales subyacen al enriquecimiento de mutaciones en los CBS asociado al tratamiento, estratificamos las SNV por las firmas mutacionales cósmicas de sustituciones de una sola base [^[11]] (SBS) (Figura 4c). Entre las firmas que se observan comúnmente en el cáncer colorrectal, SBS5 mostró un aumento pronunciado del enriquecimiento de mutaciones en los CBS en asociación con la radioterapia o la exposición a trifluridina (FDR = 3,0 × 10−4 y FDR = 4,5 × 10−5, respectivamente, según RM2; Figura 4c–e). SBS5 es una firma ampliamente distribuida, que carece de fuertes preferencias por los trinucleótidos, y se ha descrito como una firma similar a un reloj en múltiples tipos de cáncer [^[11],^[36]]. Aunque su etiología aún no se comprende completamente, se ha relacionado SBS5 con la acumulación de daños endógenos en el ADN y la reparación imperfecta del ADN [^[37]]. La asociación preferencial del enriquecimiento de mutaciones en los CBS relacionado con el tratamiento con SBS5 es, por lo tanto, consistente con la idea de que la exposición terapéutica contribuye al aumento de la acumulación de mutaciones en los sitios con una reparación del ADN restringida. En contraste, otras firmas mutacionales prevalentes en el cáncer colorrectal, incluidas SBS8, SBS17a y SBS17b, mostraron un enriquecimiento de mutaciones en los CBS tanto en los tumores tratados como en los no tratados, pero no mostraron ninguna asociación con la radioterapia o la exposición a trifluridina (Figura S3). Por lo tanto, si bien múltiples procesos mutacionales endógenos contribuyen a la carga de mutaciones en los CBS en la línea de base en el cáncer colorrectal, el aumento asociado al tratamiento del enriquecimiento de mutaciones en los CBS está capturado principalmente por SBS5.

Dado que se ha informado que la actividad de SBS5 se correlaciona con la edad en varios tipos de cáncer [^[36]], a continuación, evaluamos si las diferencias de edad entre los grupos de tratamiento podrían confundir la asociación observada entre las mutaciones de CBS asociadas a SBS5 y la exposición a la terapia. La edad del paciente en el momento de la biopsia fue comparable entre los tumores colorrectales tratados con radioterapia y los no tratados (Figura S4a), así como entre los tumores tratados con trifluridina y los no tratados (Figura S4b). Esto es consistente con los informes previos que muestran que SBS5 no está fuertemente correlacionado con la edad en el cáncer colorrectal primario [^[36]]. En conjunto, estas observaciones indican que es poco probable que la edad explique el aumento del enriquecimiento de mutaciones asociadas a SBS5 en los CBS observados en los tumores expuestos a radioterapia y trifluridina, lo que respalda un origen asociado al tratamiento de este efecto.

Las alteraciones en los genes de respuesta al daño del ADN modifican el enriquecimiento de mutaciones asociado a la radioterapia en los sitios de unión a CTCF

Las alteraciones en los genes involucrados en el mantenimiento del genoma y la respuesta al daño del ADN son comunes en el cáncer colorrectal y pueden influir en cómo los tumores responden al estrés genotóxico. Por lo tanto, preguntamos si tales alteraciones modifican el enriquecimiento de mutaciones asociado a la radioterapia en los CBS. Estratificamos los tumores colorrectales tratados con radioterapia por el estado de mutación de los genes impulsores alterados de forma recurrente anotados en el conjunto de datos HMF [^[28]]. Para cada gen impulsor, comparamos el enriquecimiento de mutaciones en los CBS asociado a la radioterapia entre los tumores con mutaciones en el gen impulsor y los tumores de tipo salvaje utilizando RM2.

Detectamos seis genes impulsores cuyas alteraciones se asociaron con diferencias en el enriquecimiento de mutaciones en los CBS dentro del subconjunto de tumores colorrectales tratados con radioterapia (FDR < 0,05; Figura 5a, Tabla S8). De manera más destacada, las alteraciones de BRCA2, observadas en diez tumores, se asociaron con un grado sustancialmente mayor de enriquecimiento de mutaciones en los CBS. Estos tumores con mutaciones en BRCA2 mostraron un mayor enriquecimiento de mutaciones en los CBS que 162 tumores de tipo salvaje de BRCA2 después de la exposición a la radioterapia (1,62 veces frente a 1,33 veces de enriquecimiento; FDR = 4,4 × 10−5; RM2; Figura 5b). BRCA2 desempeña un papel central en la reparación del ADN mediada por la recombinación homóloga, y la deficiencia de BRCA2 compromete la reparación de las roturas de doble cadena del ADN [^[38],^[39]]. El aumento del enriquecimiento de mutaciones en los CBS observado en los tumores con mutaciones en BRCA2 tratados con radioterapia es, por lo tanto, consistente con la reparación deficiente del daño inducido por la radiación, lo que aumenta la probabilidad de que las lesiones del ADN no resueltas se fijen como mutaciones en los sitios donde la reparación del ADN ya está restringida.

Además de BRCA2, las alteraciones en varios otros genes impulsores se asociaron con un aumento del enriquecimiento de mutaciones en los CBS en los genomas de los tumores colorrectales tratados con radioterapia (Figura 5a). En particular, las mutaciones en MAP3K21 y FBXW7 se asociaron con un mayor enriquecimiento de mutaciones en los CBS en comparación con los tumores de tipo salvaje (Figura 5c–d). Se ha implicado a ambos genes en la detección del daño del ADN y la regulación de la unión de extremos no homólogos [^[40]–^[42]], una vía principal para la reparación de las roturas de doble cadena inducidas por la radiación ionizante [^[43]]. Tres genes adicionales (ERBB4, ARID1A, SMAD4) también mostraron asociaciones significativas en el análisis sistemático, aunque las diferencias en el enriquecimiento de mutaciones en los CBS entre los tumores de tipo salvaje y los mutantes fueron modestas (Figura S5). En general, estos resultados indican que el enriquecimiento de mutaciones asociado a la radioterapia en los sitios de unión a CTCF está determinado no solo por el contexto cromatínico local, sino también por los defectos específicos del tumor en las vías de respuesta al daño del ADN, lo que apunta a una convergencia entre el daño del ADN inducido por la terapia y la reparación deficiente en los elementos reguladores clave.

Las terapias contra el cáncer se asocian con un enriquecimiento de mutaciones localizado en los sitios de unión a CTCF constitutivamente activos

Analizamos los datos de secuenciación del genoma completo (WGS) de 4870 tumores metastásicos de 17 tipos de cáncer del conjunto de datos de la Fundación Médica Hartwig (HMF) [^[28]] (Tabla S1). Para evaluar si las terapias contra el cáncer se asocian con una mutagénesis localizada en los sitios de unión a CTCF (CBS), nos centramos en aproximadamente 30 000 sitios de unión constitutivamente activos de CTCF identificados en muchos tipos de tejidos humanos [^[19]] (Tabla S2). Este subconjunto se definió como el que se une a CTCF en la mayoría de los tipos de células perfilados en el proyecto ENCODE [^[29]] y se seleccionó para nuestro análisis debido a un fuerte enriquecimiento de mutaciones en los genomas del cáncer [^[19],^[21]]. Los CBS se definieron como las secuencias centrales de 50 pares de bases alrededor de los puntos medios de los picos de ChIP-seq, y se compararon los recuentos de mutaciones somáticas dentro de estas regiones con las secuencias adyacentes coincidentes como controles de fondo locales. Los recuentos de mutaciones se modelaron utilizando RM2, un modelo binomial negativo que tiene en cuenta el contexto de la secuencia de trinucleótidos y la carga de mutaciones de fondo a escala de megabases, para cuantificar el enriquecimiento o el agotamiento específico de los CBS [^[19]].

Primero, realizamos un análisis computacional sistemático para identificar pares de tipos de cáncer y terapias asociados con cambios localizados en el enriquecimiento de mutaciones en los CBS (Figura 1a, Figura S1). Evaluamos 45 terapias individuales y 15 grupos de terapias en 17 tipos de cáncer, requiriendo un mínimo de 25 tumores tratados y 25 tumores no tratados en cada par para garantizar la potencia estadística (Tablas S1, S3). Para cada par de cáncer y terapia elegible, utilizamos RM2 para cuantificar el enriquecimiento de mutaciones en los CBS en relación con las regiones adyacentes inmediatas, que sirvieron como un fondo local coincidente. Luego, probamos estadísticamente si la exposición al tratamiento se asoció con un cambio en la relación de enriquecimiento de mutaciones de CBS a flancos, seguido de un ajuste de múltiples pruebas de las estimaciones de significancia.

En este análisis sistemático, identificamos 20 asociaciones significativas que involucraron a 13 terapias y cinco tipos de cáncer (FDR < 0,05; Figura 1b, Tabla S1). Entre estos, el cáncer colorrectal metastásico exhibió múltiples asociaciones fuertes y estadísticamente sólidas, con varias terapias que mostraron un aumento significativo del enriquecimiento de mutaciones en los CBS en relación con las regiones genómicas adyacentes. En el cáncer colorrectal metastásico, la radioterapia y la exposición a trifluridina mostraron las asociaciones más fuertes con el enriquecimiento de mutaciones en los CBS. Los tumores colorrectales tratados con radioterapia (n = 172) mostraron un enriquecimiento de mutaciones de 1,33 veces en los CBS en relación con las secuencias genómicas adyacentes, en comparación con un enriquecimiento de 1,24 veces en 449 tumores no tratados (FDR = 3,6 × 10−4 según RM2; Figura 1c). La exposición a trifluridina se asoció con un aumento del enriquecimiento de mutaciones en los CBS de 1,52 veces en 35 tumores tratados, en comparación con un aumento de 1,22 veces en 742 tumores no tratados (FDR = 4,9 × −13, Figura 1d). Varias terapias adicionales que se utilizan comúnmente para tratar a pacientes con cáncer colorrectal, como irinotecán, fluorouracilo, bevacizumab y agentes anti-EGFR, también mostraron asociaciones significativas con el enriquecimiento de mutaciones en los CBS (Figura 1b, Tabla S1). Sin embargo, dado que estas terapias se administran con frecuencia en combinación, sus contribuciones individuales requieren una mayor deconvolución. Estos resultados indican que los CBS constitutivamente activos son un objetivo destacado de la mutagénesis asociada a la terapia en el cáncer colorrectal metastásico.

Más allá del cáncer colorrectal, identificamos algunas asociaciones terapéuticas significativas con un enriquecimiento de la mutación CBS en otros tipos de cáncer. Por ejemplo, la exposición a bevacizumab se asoció con un aumento del enriquecimiento de la mutación CBS en el cáncer de mama luminal A (FDR = 0,0011; Figura 1e). Sin embargo, estas asociaciones generalmente mostraron efectos modestos o se basaron en un número limitado de muestras, lo que redujo su idoneidad para análisis posteriores detallados (Tabla S1). En contraste, la radioterapia y la exposición a trifluridina en el cáncer colorrectal metastásico se respaldaron con cohortes más grandes (Tabla S4) y mostraron un enriquecimiento fuerte y reproducible de la mutación CBS, lo que permitió una evaluación rigurosa de los efectos independientes del tratamiento. Por lo tanto, nos centramos en nuestros análisis posteriores en las asociaciones de tratamiento en el cáncer colorrectal metastásico para investigar los factores que dan forma a la mutagénesis asociada a la terapia en CBS.

La radioterapia y la trifluridina se asocian con un enriquecimiento de la mutación en los sitios de unión de CTCF en el cáncer colorrectal

Dado que muchos pacientes con cáncer colorrectal recibieron múltiples terapias, hubo una superposición sustancial entre los tratamientos que mostraron asociaciones significativas en el análisis sistemático inicial. Para desentrañar sus contribuciones independientes, ajustamos un modelo conjunto que incluía las seis terapias para el cáncer colorrectal identificadas a partir del análisis inicial (trifluridina, radioterapia, irinotecán, bevacizumab, fluorouracilo y terapia anti-EGFR). En este modelo, la radioterapia y la trifluridina siguieron estando significativamente asociadas con un aumento del enriquecimiento de la mutación CBS (P = 0,0050 y P = 0,036, respectivamente, Figura 2a), mientras que las otras terapias se atenuaron en gran medida y ya no fueron significativas. Estos resultados indican que las asociaciones de la radioterapia o la trifluridina con el enriquecimiento de la mutación CBS no se explican por el cotratamiento con otros agentes. Por lo tanto, nos centramos en los análisis posteriores en estas dos terapias.

Para evaluar aún más si la asociación entre la radioterapia y el enriquecimiento de la mutación CBS era robusta al contexto del tratamiento, estratificamos los tumores colorrectales tratados con radioterapia según las combinaciones de otras terapias que recibieron los pacientes (Figura 2b, Tabla S5). En particular, los tumores que recibieron radioterapia como su único tratamiento documentado mostraron un aumento significativo del enriquecimiento de la mutación CBS en comparación con los tumores sin exposición al tratamiento registrada (FDR = 4,5 × 10−6 de RM2; Figura 2c). Esta comparación proporciona evidencia de que la exposición a la radioterapia en sí está asociada con un enriquecimiento de la mutación localizado en CBS, independientemente de otras terapias. En los demás grupos de tratamiento de fondo, los tumores tratados con radioterapia generalmente mostraron un mayor enriquecimiento de la mutación CBS que los tumores sin exposición a la radioterapia (Figura 2b). Sin embargo, la mayoría de las comparaciones individuales se vieron limitadas por el tamaño de la muestra dentro de cada subgrupo y no alcanzaron la significación estadística después de la corrección de múltiples pruebas.

La radioterapia se administra con mayor frecuencia a los cánceres rectales que a los cánceres de colon [^[30]], a pesar de que estos tipos de tumores comparten características genómicas y transcriptómicas muy similares [^[31],^[32]], lo que sugiere la posibilidad de que la ubicación del tumor pueda confundir la asociación observada. Analizamos los cánceres de colon y recto por separado y observamos un enriquecimiento significativo de la mutación CBS asociada a la radioterapia tanto en la cohorte de cáncer de colon (P = 1,0 x−4) como en la cohorte de cáncer de recto (P = 8,0 × 10−4) (Figura 2d–e). Para minimizar aún más los posibles efectos de confusión, realizamos una comparación rigurosa entre los tumores colorrectales expuestos solo a la radioterapia (n = 13) y los tumores no tratados que coincidían en el tamaño de la muestra y la proporción de cáncer de recto. Incluso con este diseño conservador, los tumores tratados con radioterapia sola mostraron un enriquecimiento significativamente mayor de la mutación CBS que los tumores completamente no tratados (P = 0,032 de RM2; Figura S2), lo que indica que la asociación no se debe a la ubicación del tumor.

El contexto de la cromatina y los motivos de unión al ADN dan forma al enriquecimiento de la mutación en los sitios de unión de CTCF

Centrándonos en los cánceres colorrectales tratados con radioterapia, examinamos a continuación si las características genómicas y de la cromatina locales modulan el enriquecimiento de la mutación en los sitios de unión. Anotamos CBS constitutivamente activos con múltiples propiedades, incluida la presencia de un motivo de unión al ADN CTCF canónico, el momento de la replicación, el nivel de expresión de los genes cercanos, el anclaje del bucle de la cromatina y el contexto del dominio asociado topológicamente (TAD). Se estratificaron los CBS por cada característica y se aplicó RM2 dentro de los estratos para evaluar los cambios en el enriquecimiento de la mutación asociados a la radioterapia en relación con las regiones adyacentes. En estos análisis, el enriquecimiento de la mutación y su asociación con la radioterapia se vieron fuertemente influenciados por la presencia del motivo del ADN, el momento de la replicación y la actividad transcripcional, mientras que el anclaje del bucle de la cromatina y el contexto del TAD mostraron poco o ningún efecto (Figura 3a, Tabla S6).

La presencia de un motivo de unión al ADN CTCF canónico surgió como el determinante más fuerte del enriquecimiento de la mutación en CBS (Figura 3a–b). Los CBS que contenían el motivo canónico mostraron un claro enriquecimiento de la mutación en relación con las regiones adyacentes tanto en los tumores tratados con radioterapia como en los no tratados. Es importante destacar que la exposición a la radioterapia se asoció con un mayor aumento del enriquecimiento de la mutación en los CBS que contenían el motivo (P = 3,4 × 10−5 de RM2). En contraste, los CBS que carecían del motivo canónico mostraron poco o ningún enriquecimiento de la mutación en ninguno de los grupos de tratamiento y no se detectó ningún efecto asociado a la radioterapia. Estos resultados indican que el enriquecimiento de la mutación está muy concentrado en los CBS con motivos de unión al ADN CTCF, tanto en la línea de base como después de la exposición a la radioterapia, lo que extiende las observaciones previas de la mutagénesis centrada en CBS [^[19]]. Dado que la presencia del motivo es un indicador de la interacción directa y estable entre CTCF y el ADN [^[33]], este patrón es consistente con la noción de que la unión sostenida de proteínas puede restringir la reparación local del ADN y, por lo tanto, aumentar la probabilidad de que el daño inducido por la radiación se fije como mutaciones somáticas.

La actividad transcripcional y el momento de la replicación modulan aún más el enriquecimiento de la mutación en CBS y su asociación con la exposición a la radioterapia. Para estudiar las asociaciones transcripcionales, agrupamos los CBS en función de la baja, media o alta expresión génica. Tanto en los grupos de baja como de media expresión, la exposición a la radioterapia se asoció con un aumento significativo del enriquecimiento de la mutación CBS (CBS de baja expresión, P = 7,5 × 10−4; CBS de expresión media, P = 0,02; RM2) (Figura 3a, c). De manera similar, los CBS en las regiones genómicas que se replican tardíamente mostraron un enriquecimiento de la mutación significativamente elevado en los genomas de los tumores que habían recibido radioterapia previa (P = 3,4 × 10−5; Figura 3a, d). En ambas comparaciones, tanto los subconjuntos de tumores tratados como los no tratados mostraron enriquecimientos de mutaciones en los CBS en comparación con las regiones genómicas adyacentes (Figura 3a, c–d). En contraste, los CBS cerca de los genes altamente expresados o en las regiones genómicas que se replican temprano mostraron poco o ningún efecto asociado a la radioterapia y no mostraron enriquecimiento de la mutación en los CBS en general. Dado que la eficiencia de la reparación del ADN se reduce en las regiones que se replican tardíamente y la reparación acoplada a la transcripción opera principalmente en las regiones que se transcriben activamente [^[34],^[35]], estos patrones son consistentes con la mutagénesis asociada a la radioterapia que afecta preferentemente a los CBS ubicados en contextos genómicos con una actividad de reparación limitada. En general, estos resultados indican que el enriquecimiento de la mutación CBS y su mejora por la radioterapia están fuertemente influenciados por la presencia del motivo del ADN y el contexto de la cromatina local.

El enriquecimiento de la mutación asociada al tratamiento en los sitios de unión de CTCF está dominado por SBS5

A continuación, examinamos el espectro de mutaciones subyacente al enriquecimiento de la mutación CBS asociada al tratamiento. En el cáncer colorrectal metastásico, el aumento de la carga de mutación en los CBS fue abrumadoramente impulsado por las variantes de un solo nucleótido (SNV), que representaron la gran mayoría de las mutaciones en los CBS (94 %). De hecho, las SNV estaban muy enriquecidas en los sitios en relación con las secuencias adyacentes, y la exposición a la radioterapia se asoció con un mayor aumento del enriquecimiento de la mutación (FDR = 3,9 × 10−5 de RM2; Figura 4a, Tabla S7). En contraste, los indels en los CBS se agotaron en relación con las regiones adyacentes (P < 0,0001) y no se identificó ninguna asociación con la exposición a la radioterapia con las mutaciones de indel en los CBS (Figura 4b), a pesar de los informes previos que relacionan la radiación ionizante con las pequeñas deleciones [^[27]]. Por lo tanto, nos centramos en los análisis posteriores en las SNV.

Para determinar qué procesos de mutación subyacen al enriquecimiento de la mutación asociada al tratamiento en los CBS, estratificamos las SNV por las firmas de mutación de sustituciones de una sola base (SBS) del COSMIC [^[11]] (Figura 4c). Entre las firmas que se observan comúnmente en el cáncer colorrectal, SBS5 mostró un aumento pronunciado del enriquecimiento de la mutación CBS en asociación con la exposición a la radioterapia o la trifluridina (FDR = 3,0 × 10−4 y FDR = 4,5 × 10−5, respectivamente, de RM2; Figura 4c–e). SBS5 es una firma ampliamente distribuida, que carece de fuertes preferencias por los trinucleótidos, que se ha descrito como una firma similar a un reloj en múltiples tipos de cáncer [^[11],^[36]]. Aunque su etiología aún no se comprende del todo, se ha relacionado SBS5 con la acumulación de daños endógenos en el ADN y la reparación imperfecta del ADN [^[37]]. La asociación preferencial del enriquecimiento de la mutación CBS relacionada con el tratamiento con SBS5 es, por lo tanto, consistente con la exposición a la terapia que contribuye al aumento de la acumulación de mutaciones en los sitios con una reparación del ADN restringida. En contraste, otras firmas de mutación prevalentes en el cáncer colorrectal, incluidas SBS8, SBS17a y SBS17b, mostraron enriquecimiento de la mutación en los CBS tanto en los tumores tratados como en los no tratados, pero no mostraron ninguna asociación con la radioterapia o la exposición a la trifluridina (Figura S3). Por lo tanto, si bien múltiples procesos de mutación endógenos contribuyen a la carga de mutación CBS de la línea de base en el cáncer colorrectal, el aumento asociado al tratamiento del enriquecimiento de la mutación CBS está capturado principalmente por SBS5.

Dado que se ha informado que la actividad de SBS5 se correlaciona con la edad en varios tipos de cáncer [^[36]], evaluamos a continuación si las diferencias de edad entre los grupos de tratamiento podrían confundir la asociación observada entre las mutaciones CBS asociadas a SBS5 y la exposición a la terapia. La edad del paciente en el momento de la biopsia fue comparable entre los tumores colorrectales tratados con radioterapia y los no tratados (Figura S4a), así como entre los tumores tratados con trifluridina y los no tratados (Figura S4b). Esto es consistente con informes previos que muestran que SBS5 no está fuertemente correlacionado con la edad en el cáncer colorrectal primario [^[36]]. En conjunto, estas observaciones indican que la edad es poco probable que explique el aumento del enriquecimiento de la mutación asociada a SBS5 en los tumores expuestos a la radioterapia y la trifluridina, lo que respalda un origen asociado al tratamiento de este efecto.

Las alteraciones en los genes de respuesta al daño del ADN modifican el enriquecimiento de la mutación asociada a la radioterapia en los sitios de unión de CTCF

Las alteraciones en los genes involucrados en el mantenimiento del genoma y la respuesta al daño del ADN son comunes en el cáncer colorrectal y pueden influir en cómo los tumores responden al estrés genotóxico. Por lo tanto, preguntamos si tales alteraciones modifican el enriquecimiento de la mutación asociada a la radioterapia en los CBS. Estratificamos los tumores colorrectales tratados con radioterapia según el estado de mutación de los genes impulsores alterados de forma recurrente anotados en el conjunto de datos HMF [^[28]]. Para cada gen impulsor, comparamos el enriquecimiento de la mutación CBS asociada a la radioterapia entre los tumores con mutación del gen impulsor y los tumores de tipo salvaje utilizando RM2.

Detectamos seis genes impulsores cuyas alteraciones se asociaron con diferencias en el enriquecimiento de mutaciones en CBS dentro del subconjunto de tumores colorrectales tratados con radioterapia (FDR < 0,05; Figura 5a, Tabla S8). De manera más destacada, las alteraciones de BRCA2, observadas en diez tumores, se asociaron con un grado sustancialmente mayor de enriquecimiento de mutaciones en CBS. Estos tumores con mutaciones en BRCA2 mostraron un mayor enriquecimiento de mutaciones en CBS que 162 tumores con BRCA2 en estado silvestre después de la exposición a la radioterapia (1,62 veces mayor vs. 1,33 veces mayor de enriquecimiento; FDR = 4,4 × 10−5; RM2; Figura 5b). BRCA2 desempeña un papel central en la reparación del ADN mediada por la recombinación homóloga, y la deficiencia de BRCA2 compromete la reparación de roturas de doble cadena del ADN [^[38],^[39]]. El aumento del enriquecimiento de mutaciones en CBS observado en los tumores con mutaciones en BRCA2 tratados con radioterapia es, por lo tanto, consistente con una reparación deficiente del daño inducido por la radiación, lo que aumenta la probabilidad de que las lesiones del ADN no resueltas se fijen como mutaciones en sitios donde la reparación del ADN ya está limitada.

Además de BRCA2, las alteraciones en varios otros genes impulsores se asociaron con un mayor enriquecimiento de mutaciones en CBS en los genomas de los tumores colorrectales tratados con radioterapia (Figura 5a). En particular, las mutaciones en MAP3K21 y FBXW7 se asociaron con un mayor enriquecimiento de mutaciones en CBS en comparación con los tumores en estado silvestre (Figura 5c–d). Se ha implicado a ambos genes en la detección del daño del ADN y en la regulación de la unión de extremos no homólogos [^[40]–^[42]], una vía importante para la reparación de las roturas de doble cadena inducidas por la radiación ionizante [^[43]]. Tres genes adicionales (ERBB4, ARID1A, SMAD4) también mostraron asociaciones significativas en el análisis sistemático, aunque las diferencias en el enriquecimiento de mutaciones en CBS entre los tumores en estado silvestre y los tumores con mutaciones fueron modestas (Figura S5). En general, estos resultados indican que el enriquecimiento de mutaciones asociado a la radioterapia en los sitios de unión de CTCF no solo está determinado por el contexto cromatínico local, sino también por los defectos específicos del tumor en las vías de respuesta al daño del ADN, lo que sugiere una convergencia entre el daño del ADN inducido por la terapia y la reparación deficiente en los elementos reguladores clave.

Discusión

En este estudio, evaluamos sistemáticamente si las terapias contra el cáncer genotóxicas están relacionadas con el enriquecimiento localizado de mutaciones en los sitios de unión de CTCF (CBS) en los tumores metastásicos. En el cáncer colorrectal metastásico, la radioterapia y la exposición a trifluridina se asociaron con un mayor enriquecimiento de mutaciones en CBS, y estas asociaciones persistieron después de tener en cuenta los antecedentes de tratamiento superpuestos. Estos hallazgos indican que las terapias contra el cáncer pueden remodelar la mutagénesis en los elementos reguladores arquitectónicos y sugieren que las consecuencias genómicas del tratamiento están influenciadas por el contexto cromatínico y la capacidad de reparación del ADN. Aunque las asociaciones más fuertes se observaron en el cáncer colorrectal, el enriquecimiento de mutaciones en CBS también está presente en los tumores que no han sido expuestos a la radioterapia, y la exposición a la terapia parece amplificar este patrón de base, lo que sugiere una contribución complementaria a las diferencias intrínsecas entre los tipos de cáncer.

El enriquecimiento de mutaciones en CBS asociado a la terapia también se asoció con las características funcionales del ADN no codificante. Los CBS que contienen un motivo CTCF canónico mostraron el mayor enriquecimiento de mutaciones, lo que es consistente con la ocupación estable de CTCF-ADN y la influencia del contexto epigenético en la unión [^[33]]. Dado que se ha demostrado que la unión de factores de transcripción dificulta la reparación por escisión de nucleótidos [^[14]], la ocupación sostenida de CTCF puede limitar la accesibilidad a la reparación local, lo que aumenta la probabilidad de que el daño del ADN se fije como una mutación en estos sitios. En línea con la idea de que los sitios de CTCF son puntos calientes de mutagénesis asociada a roturas del ADN, previamente observamos que los CBS co-unidos por la topoisomerasa TOP2B exhiben un marcado enriquecimiento de SNV en los genomas del cáncer, lo que implica la dinámica de roturas de doble cadena y los procesos de reparación en estos elementos reguladores [^[21]]. Estos hallazgos respaldan un modelo en el que la mutagénesis asociada a la terapia se produce preferentemente en los elementos reguladores donde la ocupación de proteínas limita la eficiencia de la reparación.

El momento de la replicación y la actividad transcripcional contextualizan aún más estos hallazgos. Se sabe que las regiones que se replican tardíamente exhiben tasas de mutación de base más altas, en parte debido a la reducción de la eficiencia de la reparación del ADN y al estrés asociado a la replicación [^[44],^[45]]. La variación regional en las vías de reparación del ADN, incluida la reparación de errores de emparejamiento del ADN, también contribuye a la variación en la actividad del proceso de mutación en todo el genoma [^[35]]. Las vías de reparación por escisión de nucleótidos acopladas a la transcripción y globales desempeñan un papel central en la eliminación de las lesiones que distorsionan la hélice y en la prevención de la mutagénesis en todo el genoma [^[46]]. En nuestros datos, el enriquecimiento de mutaciones en CBS asociado a la radioterapia fue más evidente dentro de las regiones que se replican tardíamente y cerca de los genes de baja expresión, lo que es consistente con la reducción de la actividad de reparación en estos contextos genómicos. En conjunto, estas observaciones respaldan un modelo en el que el daño del ADN inducido por la terapia tiene más probabilidades de fijarse como una mutación en los sitios de unión de CTCF con reparación limitada.

En línea con este modelo de reparación limitada, las alteraciones en múltiples genes de respuesta al daño del ADN amplificaron aún más el enriquecimiento de mutaciones en CBS asociado a la radioterapia. Los tumores con mutaciones en BRCA2 mostraron un mayor enriquecimiento de mutaciones en CBS después de la radioterapia, en línea con el papel establecido de BRCA2 en la reparación mediada por recombinación homóloga de las roturas de doble cadena del ADN [^[38],^[39]]. De manera similar, las mutaciones en MAP3K21 y FBXW7, que están implicadas en la señalización del daño del ADN y en la regulación de la unión de extremos no homólogos [^[40]–^[42]], se asociaron con un mayor enriquecimiento de mutaciones en CBS en los tumores tratados con radioterapia. En conjunto, estos hallazgos son consistentes con la idea de que la capacidad de reparación de roturas de doble cadena comprometida aumenta la probabilidad de que las lesiones inducidas por la radiación se fijen como mutaciones en los sitios de unión de CTCF, donde la accesibilidad a la reparación ya está limitada.

El análisis de la firma mutacional indicó que el enriquecimiento de mutaciones en CBS asociado al tratamiento se capturó principalmente mediante SBS5. Aunque SBS5 carece de una fuerte especificidad de trinucleótidos y se observa ampliamente en los tipos de tumores [^[11],^[47]], se ha relacionado con el daño endógeno del ADN y la reparación imperfecta del ADN [^[36],^[37]]. La asociación del enriquecimiento de CBS relacionado con la radioterapia y la trifluridina con SBS5 es, por lo tanto, consistente con el aumento de la fijación de las lesiones del ADN en los sitios con reparación limitada en lugar de la aparición de una firma mutacional distinta y específica de la terapia. Si bien se han descrito patrones de mutación asociados a la radiación en sistemas experimentales y contextos tumorales específicos [^[3],^[27],^[48]–^[51]], una firma de radiación consistente y universalmente aceptada en los cánceres humanos sigue siendo esquiva. El perfil relativamente inespecífico de SBS5 es compatible con la fijación estocástica de las lesiones del ADN que surgen del daño inducido por la radiación ionizante, incluidas las roturas de una sola cadena que pueden convertirse en SNV cuando se reparan incorrectamente [^[52]].

Los CBS sirven como anclajes de bucles de cromatina y dominios topológicamente asociados, y se ha demostrado que la interrupción del aislamiento mediado por CTCF altera las interacciones promotor-potenciador y activa los protooncogenes a través de cambios en la estructura de la vecindad cromosómica [^[20],^[23]]. También se han identificado mutaciones somáticas en los aislantes de CTCF como posibles alteraciones no codificantes con impacto regulador en los genomas del cáncer [^[53]]. Además, previamente demostramos que los CBS co-unidos por la topoisomerasa TOP2B y los factores arquitectónicos como CTCF y RAD21 exhiben un marcado enriquecimiento de pequeñas mutaciones, especialmente en los loci impulsores del cáncer conocidos [^[21]]. Dado que el enriquecimiento de mutaciones en el presente estudio fue más fuerte en los CBS que contienen motivos, donde se espera una ocupación estable de CTCF, las mutaciones asociadas a la terapia pueden alterar la unión de CTCF y remodelar sutilmente la arquitectura de la cromatina local. Estas alteraciones podrían influir en la expresión génica o los límites del dominio regulador cercanos, lo que contribuiría a una mayor heterogeneidad molecular dentro de los tumores tratados.

Este estudio tiene varias limitaciones. Las exposiciones al tratamiento previas y posteriores al desarrollo de la enfermedad metastásica son complejas y frecuentemente correlacionadas porque los pacientes suelen recibir regímenes de múltiples fármacos y líneas de tratamiento sucesivas. Aunque se utilizó un modelo conjunto para estimar los efectos independientes, no se puede excluir una confusión residual. Además, dado que esta cohorte consta de tumores metastásicos obtenidos después de la terapia, representa una población seleccionada de cánceres que persistieron o reaparecieron después del tratamiento. El enriquecimiento de mutaciones observado refleja, por lo tanto, los procesos evolutivos en la enfermedad que sobrevivió al tratamiento y puede no capturar completamente las consecuencias mutacionales en los tumores que responden de forma duradera a la terapia. El conjunto de datos también carece de muestras pretratamiento y postratamiento emparejadas e información sobre la dosis del tratamiento, lo que impide la atribución causal directa de las mutaciones en CBS a terapias específicas. Finalmente, la potencia estadística varió entre los pares de tipos de cáncer y terapias, y se redujo en los análisis de subgrupos de tumores tratados con radioterapia estratificados por el estado de mutación del gen impulsor, lo que puede limitar la detección de efectos más pequeños.

La radioterapia sigue siendo un componente central del tratamiento en muchos tipos de cáncer con fines curativos o paliativos, y la trifluridina/tipiracil representa una terapia más reciente para el cáncer colorrectal metastásico refractario que mejora la supervivencia en pacientes previamente tratados [^[54]]. Nuestros hallazgos indican que, más allá de sus efectos citotóxicos previstos, las terapias genotóxicas dejan huellas mutacionales medibles en los elementos reguladores arquitectónicos del genoma no codificante. Este estudio extiende las consecuencias genómicas del tratamiento del cáncer a la organización del genoma de orden superior al relacionar la exposición a la terapia con la mutagénesis localizada en CBS y demostrar su modulación por el contexto cromatínico y la capacidad de reparación del ADN. Una comprensión más profunda de la mutagénesis asociada a la terapia en las regiones reguladoras puede refinar los modelos de evolución tumoral en los cánceres tratados e informar futuros estudios de la estabilidad genómica en este entorno.

Métodos

Datos de secuenciación del genoma completo (WGS).

Los datos de WGS para los tumores metastásicos en hg19 se obtuvieron de la cohorte de la Fundación Médica Hartwig (HMF) [^[28]] (descargados el 10 de julio de 2025). Todo el secuenciamiento y el procesamiento primario fueron realizados por HMF bajo protocolos de revisión institucional aprobados localmente con consentimiento informado por escrito, como se describió anteriormente [^[28]]. Este análisis secundario fue aprobado por la Junta de Ética de la Investigación de la Universidad de Toronto (protocolo 37521). Utilizamos las llamadas de variantes somáticas, las anotaciones de genes impulsores, los perfiles de ARN-seq (cuando estén disponibles) y los metadatos clínicos proporcionados por HMF, incluido el historial de tratamiento prebiopsia, la edad al momento de la biopsia y el sitio de la biopsia metastásica [^[28]]. Los tumores se agruparon por tipo de cáncer primario y se excluyeron los tipos de cáncer con menos de 25 muestras o de tipo primario desconocido. Cuando se dispuso de múltiples biopsias por paciente, seleccionamos una muestra en función de la disponibilidad de la información del tratamiento. Para reducir la influencia de los hipermutadores extremos, se excluyeron los tumores con >90.000 mutaciones somáticas. Los adenocarcinomas de colon y recto se analizaron juntos como tumores colorrectales para los análisis primarios y también confirmamos los hallazgos en los tumores de colon y recto por separado.### Información del tratamiento y anotaciones clínicas.

Se recopilaron los antecedentes de tratamiento pre-biopsia para armonizar los nombres de los tratamientos, los alias y los componentes del régimen. Dado que terapias relacionadas, como aquellas dentro de la misma clase de fármacos, pueden inducir patrones de mutación similares [^[3]], analizamos tanto los tratamientos individuales como los grupos de tratamiento predefinidos (Tabla S2). Los tratamientos se agruparon utilizando la jerarquía del Tesauro del NCI (v25.10d) [^[55]]. Para los análisis agrupados, se etiquetó un tumor como "tratado" si el paciente recibió alguna terapia dentro del grupo antes de la biopsia, y como "no tratado" en caso contrario. La edad del paciente en el momento de la biopsia se estimó a partir del año de nacimiento y el año de la biopsia. No se pudo obtener la edad para 881 pacientes debido a la falta del año de nacimiento y/o del año de la biopsia; estas muestras se excluyeron de los análisis que requerían la edad.

Sitios de unión de CTCF (CBS).

Los CBS se definieron como los 32.442 sitios de unión constitutivamente activos de nuestro trabajo anterior [^[19]]. En resumen, los picos de ChIP-seq de CTCF preprocesados previamente de 70 líneas celulares ENCODE que abarcan diversos tejidos se agregaron [^[29],^[56]]. Los picos se dividieron en 5 grupos según el número de líneas celulares con unión de CTCF activa. El grupo 1 estaba unido a CTCF en 52-70 líneas celulares (mediana 67) y se definió como sitios constitutivamente activos. Este subconjunto de sitios mostró el enriquecimiento de mutaciones más fuerte y consistente en tumores primarios en nuestro análisis anterior [^[19]]. Como control de calidad, confirmamos que el enriquecimiento de mutaciones en la cohorte metastásica de HMF también se concentraba en este grupo (Figura S1).

Evaluación del enriquecimiento de mutaciones local en CBS.

Utilizamos RM2 (v1.0.5), un marco de regresión binomial negativa para probar la variación del enriquecimiento de mutaciones localizado en una clase de elementos genómicos en relación con el fondo local [^[19]]. Para cada sitio, definimos el elemento como la secuencia central de 50 pb (±25 pb desde el centro del pico) y utilizamos las regiones inmediatamente adyacentes del mismo tamaño (50 pb a cada lado) como fondo local. RM2 modela los recuentos de mutaciones con el contexto de trinucleótidos y la carga de mutaciones de fondo a escala de megabases como covariables. Se considera que un efecto de enriquecimiento específico de CBS se apoya cuando el modelo que incluye un indicador de sitio se ajusta significativamente mejor que el modelo sin él, según una prueba de razón de verosimilitud. Para comparar grupos de tumores en función de la anotación genómica o clínica (por ejemplo, exposición al tratamiento, estado de mutación del gen impulsor), incluimos un término de interacción entre la etiqueta del grupo y el indicador del sitio (es decir, CBS frente a secuencias genómicas adyacentes) según lo definido en RM2. La significación se evaluó mediante una prueba de razón de verosimilitud (ji-cuadrado) de modelos con y sin la interacción. Una interacción significativa indica que el grupo modifica el enriquecimiento de mutaciones de CBS en relación con el fondo local (es decir, altera la relación de enriquecimiento de mutaciones de CBS a flancos). Los valores p de RM2 se ajustaron para la corrección de pruebas múltiples utilizando la tasa de descubrimiento falso (FDR) de Benjamini-Hochberg [^[57]] y se seleccionaron los resultados significativos (FDR < 0,05).

Análisis de las combinaciones de tratamiento asociadas con el enriquecimiento de mutaciones de CBS en el cáncer colorrectal.

Para estimar las contribuciones independientes de las terapias superpuestas en el cáncer colorrectal, ajustamos un modelo de regresión lineal multivariable con exposiciones binarias al tratamiento como predictores y la fracción de mutaciones somáticas que ocurren dentro de los CBS para cada tumor, definida como el número de mutaciones de CBS (SNV, indels) dividido por el número total de mutaciones somáticas en ese tumor. Se incluyeron seis exposiciones al tratamiento (trifluridina, radioterapia, irinotecán, bevacizumab, fluorouracilo, anti-EGFR). Los coeficientes y los intervalos de confianza del 95% se estimaron a partir de los modelos de regresión y se utilizaron pruebas t de dos colas para probar si cada coeficiente era diferente de cero.

Firmas de sustitución de una sola base (SBS) y mutaciones de CBS.

Se utilizó el método SigProfilerAssignment y el paquete R (v0.0.23) [^[58]] para estimar la contribución de las firmas de SBS [^[11]] en cada genoma de cáncer completo utilizando las definiciones de firmas de SBS de la base de datos COSMIC (v3.4) [^[59]]. Para cada categoría de trinucleótidos SNV en una muestra, SigProfilerAssignmentR proporciona la probabilidad a posteriori de que una SNV sea generada por cada firma dado su contexto de trinucleótidos. Luego, las mutaciones se asignaron a la firma de SBS con la probabilidad más alta dado su trinucleótido, de manera similar a los estudios anteriores [^[60]–^[62]]. Para analizar firmas de mutación específicas, se utilizó RM2 en subconjuntos individuales de SNV asignados a cada una de las firmas de SBS, excluyendo las firmas poco frecuentes que tienen menos de 100 SNV en los CBS y sus regiones adyacentes.

Estratificación de CBS por características genómicas y funcionales.

Para caracterizar funcionalmente el enriquecimiento de mutaciones en CBS con respecto al tratamiento con radioterapia, los CBS se anotaron por la presencia de motivos de ADN canónicos, el momento de la replicación, la expresión génica cercana, la superposición con los anclajes del bucle de cromatina y la superposición con los límites de TAD. La presencia de motivos de unión de ADN canónicos de CTCF en los CBS se obtuvo del estudio de Lee et al. [^[17]], que se determinaron utilizando el método FIMO [^[63]] con el motivo MA0139.1 de la base de datos JASPAR [^[64]], seleccionando los sitios con coincidencias significativas (FDR < 0,01). Los perfiles de momento de replicación de la línea celular de cáncer colorrectal HCT116 se obtuvieron de un estudio anterior [^[65]] (GEO: GSE158008). Los grupos genómicos de 1 kbp se agruparon como regiones de replicación temprana (25% superior), regiones de replicación media (50% medio) y regiones de replicación tardía (25% inferior) en función de las puntuaciones promedio ponderadas (WA). Los subconjuntos de CBS que se superponían con varios tipos de regiones (29 sitios) o carecían de WA (1101 sitios) se excluyeron. Debido a que hay menos CBS en las regiones de replicación tardía (Figura S6), los CBS en las regiones de replicación media y tardía se agruparon y se compararon con los CBS en las regiones de replicación temprana en los análisis relevantes de los procesos de mutación basados en CBS. Para la actividad transcripcional en los CBS, utilizamos datos de ARN-seq coincidentes de 391 tumores colorrectales de HMF [^[28]], que incluían genes codificantes de proteínas y lncRNA. Calculamos los valores de expresión medianos para cada gen en todas las muestras y luego dividimos los genes en tres grupos iguales como alta, media o baja expresión. A continuación, se asignaron los CBS a los genes en función de las ventanas genómicas de 3 kbp. Los CBS se anotaron como de alta expresión si eran adyacentes a al menos un gen de alta expresión. Los sitios que son adyacentes a al menos un gen de expresión media, pero no a ningún gen de alta expresión, se anotaron como de expresión media y, de lo contrario, se anotaron como de baja expresión. A continuación, se recuperaron los anclajes del bucle de cromatina de dos líneas celulares de cáncer colorrectal (HT29, LoVo) de un estudio de HiC de captura de promotores anterior [^[66]]. La información de los límites de TAD de las células madre embrionarias humanas (H1) y las líneas celulares de fibroblastos pulmonares (IMR90) se recuperó de un estudio anterior [^[67]], asumiendo que los límites de TAD se conservan en gran medida entre los tipos de células [^[67]] y, por lo tanto, son apropiados para el análisis de mutaciones en el cáncer colorrectal. Los CBS se anotaron en los anclajes de bucle y los límites de TAD en función de las superposiciones de coordenadas con los CBS en función de los picos de ChIP-seq constitutivos de CTCF derivados de ENCODE [^[29]]. Para cada subconjunto de CBS estratificados por características, se utilizó RM2 para analizar el enriquecimiento de mutaciones de CBS a flancos en las muestras agrupadas por estado de radioterapia. Los valores p de RM2 se ajustaron para la corrección de pruebas múltiples utilizando la FDR de Benjamini-Hochberg y se seleccionaron los resultados significativos (FDR < 0,05).

Análisis de las mutaciones del gen impulsor asociadas con el enriquecimiento de mutaciones de CBS en el cáncer colorrectal.

El estado de mutación del gen impulsor de cada muestra se obtuvo de HMF [^[28]], que considera las SNV y los indels codificantes de proteínas, las interrupciones del empalme, los puntos calientes de mutación, la inactivación bialélica, dNdS y las alteraciones del número de copias, como se describió anteriormente [^[68]]. Los análisis de los modificadores del gen impulsor se restringieron a los tumores colorrectales tratados con radioterapia, mientras que el tratamiento con trifluridina no se analizó por separado debido al tamaño limitado de la muestra. Designamos las muestras como mutadas en un gen impulsor si tenían alguna mutación funcional en el gen según las anotaciones de HMF, y de tipo salvaje en caso contrario. Analizamos los genes impulsores con al menos 10 muestras en los grupos mutado y de tipo salvaje. Se utilizó RM2 para comparar el enriquecimiento de mutaciones de CBS en las muestras agrupadas por estado del gen impulsor (mutado frente a tipo salvaje). Los valores p de RM2 se ajustaron para la corrección de pruebas múltiples utilizando la FDR de Benjamini-Hochberg y se seleccionaron los resultados significativos (FDR < 0,05).

Datos de secuenciación del genoma completo (WGS).

Los datos de WGS para los tumores metastásicos en hg19 se obtuvieron de la Hartwig Medical Foundation (HMF) [^[28]] (descargados el 10 de julio de 2025). Todo el secuenciación y el procesamiento primario fueron realizados por HMF bajo protocolos de la Junta de Revisión Institucional aprobados localmente con consentimiento informado por escrito, como se describió anteriormente [^[28]]. Esta análisis secundario fue aprobado por la Junta de Ética de la Investigación de la Universidad de Toronto (protocolo 37521). Utilizamos las llamadas de variantes somáticas, las anotaciones de los genes impulsores, los perfiles de ARN-seq (cuando estén disponibles) y los metadatos clínicos proporcionados por HMF, incluido el historial de tratamiento pre-biopsia, la edad en el momento de la biopsia y el sitio de la biopsia metastásica [^[28]]. Los tumores se agruparon por tipo de cáncer primario y se excluyeron los tipos de cáncer con menos de 25 muestras o de tipo primario desconocido. Cuando se dispuso de múltiples biopsias por paciente, seleccionamos una muestra en función de la disponibilidad de la información del tratamiento. Para reducir la influencia de los hipermutadores extremos, se excluyeron los tumores con >90.000 mutaciones somáticas. Los adenocarcinomas de colon y recto se analizaron juntos como tumores colorrectales para los análisis primarios y también confirmamos los hallazgos en los tumores de colon y recto por separado.

Información del tratamiento y anotaciones clínicas.

Se recopilaron los antecedentes de tratamiento pre-biopsia para armonizar los nombres de los tratamientos, los alias y los componentes del régimen. Dado que las terapias relacionadas, como aquellas dentro de la misma clase de fármacos, pueden inducir patrones de mutación similares [^[3]], analizamos tanto los tratamientos individuales como los grupos de tratamiento predefinidos (Tabla S2). Los tratamientos se agruparon utilizando la jerarquía del Tesauro del NCI (v25.10d) [^[55]]. Para los análisis agrupados, se etiquetó un tumor como "tratado" si el paciente recibió alguna terapia dentro del grupo antes de la biopsia, y como "no tratado" en caso contrario. La edad del paciente en el momento de la biopsia se estimó a partir del año de nacimiento y el año de la biopsia. No se pudo obtener la edad para 881 pacientes debido a la falta del año de nacimiento y/o del año de la biopsia; estas muestras se excluyeron de los análisis que requerían la edad.

Sitios de unión de CTCF (CBS).

Los CBS se definieron como los 32.442 sitios de unión constitutivamente activos de nuestro trabajo anterior [^[19]]. En resumen, los picos de ChIP-seq de CTCF preprocesados previamente de 70 líneas celulares ENCODE que abarcan diversos tejidos se agregaron [^[29],^[56]]. Los picos se dividieron en 5 grupos según el número de líneas celulares con unión de CTCF activa. El grupo 1 estaba unido a CTCF en 52-70 líneas celulares (mediana 67) y se definió como sitios constitutivamente activos. Este subconjunto de sitios mostró el enriquecimiento de mutaciones más fuerte y consistente en tumores primarios en nuestro análisis anterior [^[19]]. Como control de calidad, confirmamos que el enriquecimiento de mutaciones en la cohorte metastásica de HMF también se concentraba en este grupo (Figura S1).

Evaluación del enriquecimiento de mutaciones local en CBS.

Utilizamos RM2 (v1.0.5), un marco de regresión binomial negativa para evaluar la variación del enriquecimiento de mutaciones localizadas en una clase de elementos genómicos en relación con el fondo local [^[19]]. Para cada sitio, definimos el elemento como la secuencia central de 50 pb (±25 pb desde el centro del pico) y utilizamos las regiones inmediatamente adyacentes del mismo tamaño (50 pb a cada lado) como fondo local. RM2 modela los recuentos de mutaciones con el contexto de trinucleótidos y la carga de mutaciones de fondo a escala de megabases como covariables. Se considera que existe un efecto de enriquecimiento específico de CBS cuando el modelo que incluye un indicador de sitio se ajusta significativamente mejor que el modelo que no lo incluye, según una prueba de razón de verosimilitud. Para comparar grupos de tumores en función de la anotación genómica o clínica (por ejemplo, exposición al tratamiento, estado de mutación de un gen impulsor), incluimos un término de interacción entre la etiqueta del grupo y el indicador del sitio (es decir, CBS frente a secuencias genómicas adyacentes), según lo definido en RM2. La significación se evaluó mediante una prueba de razón de verosimilitud (ji-cuadrado) de modelos con y sin la interacción. Una interacción significativa indica que el grupo modifica el enriquecimiento de mutaciones de CBS en relación con el fondo local (es decir, altera la proporción de enriquecimiento de mutaciones de CBS en comparación con las regiones adyacentes). Los valores p de RM2 se ajustaron para la corrección de pruebas múltiples utilizando la tasa de descubrimiento falso (FDR) de Benjamini-Hochberg [^[57]], y se seleccionaron los resultados significativos (FDR < 0,05).

Análisis de las combinaciones de tratamiento asociadas con el enriquecimiento de mutaciones de CBS en el cáncer colorrectal.

Para estimar las contribuciones independientes de las terapias superpuestas en el cáncer colorrectal, ajustamos un modelo de regresión lineal multivariable con exposiciones binarias al tratamiento como predictores y la fracción de mutaciones somáticas que ocurren dentro de CBS para cada tumor, definida como el número de mutaciones de CBS (SNV, indels) dividido por el número total de mutaciones somáticas en ese tumor. Se incluyeron seis exposiciones al tratamiento (trifluridina, radioterapia, irinotecán, bevacizumab, fluorouracilo, anti-EGFR). Los coeficientes y los intervalos de confianza del 95% se estimaron a partir de los modelos de regresión, y se utilizaron pruebas t de dos colas para evaluar si cada coeficiente difería de cero.

Firmas de sustitución de una sola base (SBS) y mutaciones de CBS.

El método SigProfilerAssignment y el paquete R (v0.0.23) [^[58]] se utilizaron para estimar la contribución de las firmas SBS [^[11]] en cada genoma tumoral completo, utilizando las definiciones de firmas SBS de la base de datos COSMIC (v3.4) [^[59]]. Para cada categoría de trinucleótidos SNV en una muestra, SigProfilerAssignmentR proporciona la probabilidad a posteriori de que una SNV sea generada por cada firma, dado su contexto de trinucleótidos. Luego, las mutaciones se asignaron a la firma SBS con la probabilidad más alta, dado su trinucleótido, de manera similar a estudios anteriores [^[60]–^[62]]. Para analizar firmas mutacionales específicas, se utilizó RM2 en subconjuntos individuales de SNV asignados a cada una de las firmas SBS, excluyendo las firmas poco frecuentes que tienen menos de 100 SNV en CBS y sus regiones adyacentes.

Estratificación de CBS por características genómicas y funcionales.

Para caracterizar funcionalmente el enriquecimiento de mutaciones en CBS con respecto al tratamiento con radioterapia, se anotaron los CBS por la presencia de motivos de ADN canónicos, el momento de la replicación, la expresión génica cercana, la superposición con los anclajes de los bucles de cromatina y la superposición con los límites de TAD. La presencia de motivos de unión de ADN canónicos de CTCF en CBS se obtuvo del estudio de Lee et al. [^[17]], que se determinó utilizando el método FIMO [^[63]] con el motivo MA0139.1 de la base de datos JASPAR [^[64]], seleccionando los sitios con coincidencias significativas (FDR < 0,01). Los perfiles del momento de replicación de la línea celular de cáncer colorrectal HCT116 se obtuvieron de un estudio anterior [^[65]] (GEO: GSE158008). Los bins genómicos de 1 kbp se agruparon como regiones de replicación temprana (25% superior), regiones de replicación media (50% medio) y regiones de replicación tardía (25% inferior) en función de las puntuaciones promedio ponderadas (WA). Se excluyeron los subconjuntos de CBS que se superponían con varios tipos de regiones (29 sitios) o que carecían de WA (1101 sitios). Debido a que hay menos CBS en las regiones de replicación tardía (Figura S6), los CBS en las regiones de replicación media y tardía se agruparon y se compararon con los CBS en las regiones de replicación temprana en los análisis relevantes de los procesos mutacionales basados en CBS. Para la actividad transcripcional en CBS, utilizamos datos de ARN-seq coincidentes de 391 tumores colorrectales de HMF [^[28]], que incluían genes codificantes de proteínas y lncRNA. Calculamos los valores de expresión medianos para cada gen en todas las muestras y luego dividimos los genes en tres grupos iguales como alta, media o baja expresión. A continuación, se asignaron los CBS a los genes en función de las ventanas genómicas de 3 kbp. Los CBS se anotaron como de alta expresión si eran adyacentes a al menos un gen de alta expresión. Los sitios que son adyacentes a al menos un gen de expresión media, pero no a ningún gen de alta expresión, se anotaron como de expresión media, y de otro modo se anotaron como de baja expresión. A continuación, se recuperaron los anclajes de los bucles de cromatina de dos líneas celulares de cáncer colorrectal (HT29, LoVo) de un estudio de HiC de captura de promotores anterior [^[66]]. La información de los límites de TAD de las células madre embrionarias humanas (H1) y las líneas celulares de fibroblastos pulmonares (IMR90) se recuperó de un estudio anterior [^[67]], asumiendo que los límites de TAD se conservan en gran medida entre los tipos de células [^[67]] y, por lo tanto, son apropiados para el análisis de mutaciones en el cáncer colorrectal. Los CBS se anotaron en los anclajes de los bucles y los límites de TAD en función de las superposiciones de coordenadas con los CBS en función de los picos constitutivos de ChIP-seq de CTCF derivados de ENCODE [^[29]]. Para cada subconjunto de CBS estratificados por características, se utilizó RM2 para analizar el enriquecimiento de mutaciones de CBS en comparación con las regiones adyacentes en las muestras agrupadas por estado de radioterapia. Los valores p de RM2 se ajustaron para la corrección de pruebas múltiples utilizando la FDR de Benjamini-Hochberg, y se seleccionaron los resultados significativos (FDR < 0,05).

Análisis de las mutaciones de genes impulsores asociadas con el enriquecimiento de mutaciones de CBS en el cáncer colorrectal.

El estado de mutación de los genes impulsores de cada muestra se obtuvo de HMF [^[28]], que considera las SNV y los indels codificantes de proteínas, las alteraciones de la empalme, los puntos calientes de mutación, la inactivación bialélica, dNdS y las alteraciones del número de copias, como se describió anteriormente [^[68]]. Los análisis de los modificadores de los genes impulsores se restringieron a los tumores colorrectales tratados con radioterapia, mientras que el tratamiento con trifluridina no se analizó por separado debido al tamaño limitado de la muestra. Designamos las muestras como mutadas en un gen impulsor si tenían alguna mutación funcional en el gen según las anotaciones de HMF, y de otro modo se designaron como de tipo salvaje. Analizamos los genes impulsores con al menos 10 muestras en los grupos mutados y de tipo salvaje. Se utilizó RM2 para comparar el enriquecimiento de mutaciones de CBS en las muestras agrupadas por estado del gen impulsor (mutado frente a tipo salvaje). Los valores p de RM2 se ajustaron para la corrección de pruebas múltiples utilizando la FDR de Benjamini-Hochberg, y se seleccionaron los resultados significativos (FDR < 0,05).